


На правах рукописи
БАКАНЕВА ВАЛЕНТИНА ФЕДОРОВНА
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА
ИЗ ЛИЧИНОК GALLERIA MELL ONELLA И ПРОДУКТОВ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПЧЕЛ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ КАРДИОПРОТЕКТОРЫ И АДАПТОГЕНЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ
гиподинамических И СТРЕССОРНЫХ ФАКТОРОВ НА ОРГАНИЗМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ
Москва 2002г.
ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
14.00.51. - Восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель к.б.н. Спиридонов Н.А.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение..... 4
Обзор литературы..................................................................................................................... 7
ГЛАВА 1. Биологически активные вещества в личинках Gallerнa mellonella и продуктах жизнедеятельности пчел.................................................................................... 7
1.1. Биологически активные вещества в личинках Gallerнa mellonella........... 7
1.1.1. Антимикробные факторы................................................................. 8
1.1.2. Стероидные гармоны и у-аминомаслянная кислота в личинках Gallerнa mellonella........................................................................................... 9
1.2. Биологически активные вещества в продуктах жизнедеятельности пчел ... 9
1.2.1. Ферменты........................................................................................ 10
1.2.2. Антибиотические вещества............................................................ 11
1.2.3. Гормоны и медиаторы................................................................... 12
1.2.4. Витамины........................................................................................ 12
ГЛАВА 2. Стероидные гормоны насекомых и их действие в организме млекопитающих 13
ГЛАВА 3. Сердечно-сосудистая система как модель поиска новых средств лечения
болезней сердца....................................................................................... 17
Экспериментальная часть............................................................. :...................................... 20
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования................................................................... 20
4.1. Выращивание личинок Gallerнa mellonella и экстракция биологически активных веществ (БАВ).............................................................................................. 20
4.2. Выделение и очистка биологически активных компонентов личинок Gallerнa mellonella........................................................................................................ 20
4.3. Скрининг и изучение химического состава биологически активных компонент экстракта восковой моли ........................................................................... 23
ГЛАВА 5. Объекты исследования....................................................................................... 24
5.1. Изучение сократительной активности сердца крысы in vitro и гладких мышц миометрия и сосудов................................................................................... 24
5.2. Изучение энергетического обмена в сердце крысы................................. 25
5.3. Изучение цитотоксичности клеточных культур лимфобластоидных клеток человека линии Raj i.................................................................................................. 25 ,
ГЛАВА 6. Результаты и обсуждение................................................................................... 26
6.1. Химическое разделение экстракта из большой восковой моли.............. 26
6.2. Биохимическая характеристика биологически активных фракций из личинок Gallerнa mellonella...................................................................................................... 27
6.2.1. Молекулярная масса протеазы..................................................... 27
6.2.2. Оптимум рН протеазы.............................. ................................... 28
3
6.2.3. Ингибиторный анализ протеазы................................................... 28
6.2.4. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность протеазы ... 29
6.2.5. Стабильность протеазы и устойчивость к действию органических растворителей.......................................................................................................... 29
6.3. Локализация протеазы в организме личинок Gallerнa mellonella............ 30
6.4. Щелочная сериновая протеаза из личинок Gallerнa mellonella................ 31
6.5. Физико-химическая характеристика биологически активной фракции 7-А-25 33
6.5.1. Растворимость и элементный состав............................................. 33
6.5.2. Химический состав фракции 7-А-25............................................. 33
6.6. Биологическая характеристика биологически активной фракции 3LH-20 .. 34
6.6.1. Происхождение фактора стимулирующего сокращение гладких
мышц миометрия и сосудов..................................................................... 35
6.7. Влияние экстракта из личинок Gallerнa mellonella на гладкие мышцы миометрия и сосудов........................................................................................................... 36
6.8. Влияние экстракта из личинок Gallerнa mellonella (большая восковая моль) на сердце крысы in vivo и in vitro................................................................................. 37
6.8.1. Влияние экстракта большой восковой моли на сердце при физических нагрузках........................................................................................................... 37
6.8.2. Влияние экстракта большой восковой моли на давление и свертываемость крови........................................................................................................... 37
6.8.3. Кардиозащитное действие экстракта большой восковой моли.. 38
6.8.4. Влияние на энергетический обмен и токсичность....................... 39
6.9. Растительные источники: что получают пчелы от медоносных растений .. 40
6.9.1. Влияние продуктов жизнедеятельности пчел на сердце, гладкие мышцы миометрия и сосуды........................................................................................... 45
6.9.2. Скрининговый анализ продуктов жизнедеятельности пчел....... 47
6.9.3. Цитотоксичность продуктов пчелиной семьи на культурах лимфо- бластоидных клеток человека линии Raji............................................................ 48
6.9.4. Витаминно-лекарственные мёды. Реальность и перспектива их использования........................................................................................................... 49
6.9.5. Практическое исследование препарата из экстракта большой восковой моли Gallerнa mellonella на автоматизированном компьютерном комплексе экспресс-диагностики................................................................................................. 51
ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................................... 54
ВЫВОДЫ................................................................................................................................... 56
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................... 58
4
ВВЕДЕНИЕ
В связи с негативными изменениями экологической ситуации во всем мире, особое внимание уделяется репродуктивному здоровью населения, как интегральному показателю развития и сохранения всего человечества. Коренным образом изменился характер лекарственных веществ. Пища и лекарства, слившись вместе в единый поток биологически активных веществ все больше выходят из-под контроля природы и попадают под господство технологии. Природная среда меняется в связи с трудовыми процессами человека. Проблема чистых экологических продуктов, лекарств стала актуальной на сегодняшний день. Встает вопрос, как найти такой оптимальный подход к природе, при котором противоречия между человеком и средой не стало бы губительным для жизни началом?
Данная работа предлагает альтернативное решение проблемы в области биологии и медицины, обратившись к изучению старинного народного целительного средства из восковой моли.
Восковая моль (Gallerнa mellonella) одно из немногих живых существ, эволюционно приспособленных к обитанию в пчелином улье. Своё название она получила за универсальную способность переваривать и усваивать пчелиный воск. Развиваясь в улье, личинки большой восковой моли разрушают соты и повреждают расплод пчел. По этой причине большая восковая моль не пользуется любовью пасечников, однако, мало кому известны её лечебные свойства, способные перекрыть наносимый ущерб. А между тем, личинки восковой моли издавна используются в русской народной медицине для лечения возрастных заболеваний и туберкулёза. Возрождению старинного средства мы обязаны московскому врачу-гомеопату С.А.Мухину.
Согласно клиническим данным препарат из личинок восковой моли способен заживлять туберкулезные каверны в легких, залечивать свежие рубцы миокарда, способствуя их рассасыванию и замещению сократительной тканью.
Чтобы ответить на вопрос об активном начале экстракта личинок Gallerнa mellonella, необходимы сравнительные данные о влиянии продуктов жизнедеятельности пчел на препарат сердечно-сосудистой системы, а также проанализировать, какой вклад вносят продукты пчеловодства, являясь одновременно и естественным кормом личинок, и продуктом питания и лечения человека, в создании лечебного препарата из личинок Gallerнa mellonella.
На основании полученных нами результатов и литературных данных представляется возможным высказать некоторые предположения о механизме терапевтического действия
5
экстракта личинок (Gallerнa mellonella), а также расширить спектр биологического действия продуктов жизнедеятельности пчел на клеточном уровне и на уровне целого организма млекопитающих и человека.
Цель работы заключалась в изучении биологически активных веществ из личинок (Gallerнa mellonella) и продуктов жизнедеятельности пчел (меда, цветочной пыльцы, перги, прополиса, маточного молочка) на сердечно-сосудистую систему и гладкие мышцы миометрия при действии гиподинамических и стрессорных факторов на организм экспериментальных животных и человека. Задачи:
- Изучить биохимический состав и физико-химические свойства биологически активных веществ (БАВ) в экстракте из личинок (Gallerнa mellonella);
- Исследовать действие экстракта из личинок (Gallerнa mellonella) на сердечнососудистую систему и гладкие мышцы миометрия экспериментальных животных (in vivo, in vitro) с целью оценки кардиопротекторных и адаптогенных свойств;
- Изучить влияние продуктов жизнедеятельности пчел (меда, перги, цветочной пыльцы, прополиса) на сократительную активность сердца и гладкие мышцы для оценки вклада продуктов пчеловодства в биологически активную добавку из личинок (Gallerнa mellonella);
- Использовать возможности автоматизированного компьютерного комплекса экспресс-диагностики при массовом мониторинге функционального состояния человека при приеме БАД (в виде экстракта из личинок Gallerнa mellonella). Научная новизна и практическая ценность работы:
В настоящей работе исследовано действие БАВ экстракта из личинок (Gallerнa mellonella) на сердечно-сосудистую систему и гладкие мышцы животных, а также расширен спектр биологического действия продуктов жизнедеятельности пчел.
Определено количественное содержание ацетилхолина и серотонина в продуктах пчеловодства (меде, перге, цветочной пыльце, прополисе).
Проведена оценка факторов, стимулирующих сократительную активность на препаратах гладких мышц и сердца крысы. Исследован химический состав выделенных биологически активных фракций. Показано, что присутствие данных факторов в экстракте обусловлено поглощением личинками (Gallerнa mellonella) продуктов жизнедеятельности пчел. Из личинок (Gallerнa mellonela) впервые выделен протеолитический фермент (сериновая протеаза), исследованы его биохимические характеристики (молекулярный вес, оптимум рН, влияние ионов 2-х валентных металлов и температуры на ферментативную активность), выявлена его локализация в организме насекомого.
6
На основании собственных и литературных данных обсуждается вопрос о терапевтическом действии препарата из личинок (Gallerнa mellonela).
Полученные данные расширяют представления о возможности использования БАВ экстракта из личинок (Gallerнa mellonela) для повышения устойчивости организма к неблагоприятным условиям и коррекции с его помощью патологических состояний.
Результаты работы могут представлять интерес для специалистов в областях: экологии биоресурсов, физиологии и биохимии насекомых, биологически активных соединений и медицины (профилактики и лечения заболеваний, используя альтернативные методы народной медицины), а также специалистов в области фармакосанации - разделе фармакологии о действии БАВ, поступающих в организм с пищей или в виде лекарственных препаратов.
7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА В ЛИЧИНКА GALLERIA MELLONELLA И ПРОДУКТАХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПЧЁЛ
1.1. Биологически активные вещества в личинках Gallerнa mellonella
Большая восковая моль Gallerнa mellonella L. Является одним из представителей семейства огневок (Pyralidae, Lepidoptera), (рис. 1). Она получила свое название за чрезвычайно редкую среди животных способность переваривать и усваивать пчелиный воск (Росс и др. 1985; Тишенко 1986). Пищевой рацион личинок большой восковой моли уникален. В естественных условиях обитания развитие насекомого происходит в пчелином улье, где личинки поглощают большие количества таких богатых биологически активными веществами субстратов, как перга, мед и пчелиный воск, содержащий прополис. Особый интерес представляет использование препарата личинок большой восковой моли в народной медицине и гомеопатии. Экстракт, получаемый из личинок большой восковой моли (препарат "Vita"), применяется для лечения атеросклерозов, стенокардии, сердечной аритмии, ишемии, инфаркта миокарда, аневризме аорты и туберкулеза, а также в качестве гериатрического средства.
Большая восковая моль является традиционным объектом исследования биохимии и физиологии насекомых. Имеется довольно много работ, посвященных изучению морфологии и гистологии, развития и метаморфоза, метаболизма липидов, углеводов и азотистых соединений, гормональной и иммунной систем этого насекомого (см.: Wigglesworth, 1967; Kerkut and Gilbert, 1985). Тем не менее, до настоящего времени относительно мало внимания уделялось исследованию биологически активных веществ из личинок большой восковой моли.
Личинки большой восковой моли обладают чрезвычайно высоким иммунитетом по отношению к ряду микроорганизмов, патогенных для человека (возбудители туберкулеза, дифтерии, столбняка, чумы и некоторые? другие). Гемолимфа и экстракты, полученные из предварительно иммунизированных личинок большой восковой моли, оказывали логическое действие на туберкулезные бактерии в условиях in vitro. Введение гемолимфы личинок морским свинкам, инфицированным туберкулезной палочкой, тормозило развитие заболевания. Метальников пришел к выводу о том, что высокий иммунитет личинок и антимикробное действие их гемолимфы обусловлено церазой - ферментом, расщепляющим воск (Metalnikov, 1906,1920, 1935).
8
1.1.1. Антимикробное действие экстрактов личинок большой восковой моли по отношению к Mycobacterium tuberculosis било подтверждено рядом других авторов (Olivier, 1947; Kuzniecow and Wojciechowski, 1950; Paszewski, 1959). Ферментный препарат, обладающий сильной липолитической активностью по отношению к липидам Mycobacterium tuberculosis, и разрушительно действующий на туберкулезные бактерии, культивируемые in vitro, был выделен из личинок большой восковой моли Манкиевич (Mankiewicz, 1949; 1952). По данным других авторов, личинки большой восковой моли содержат антитуберкулезный фактор небелковой природы, не обладающий липолитической активностью (Dudziak et
al„ 1962).
Рис. 1. Восковая моль (большая): 1- сот, пораженный молью; 2-} гусеница; 3 - кокон; 4- куколка; 5 - бабочка-самец; 6 - бабочка самка; 7 - яйца на стенках ячейки
6
В последние годы в гемолимфе личинок большой восковой моли были обнаружены неспецифические бактериолизины, представляющие собой основные белки, обладающие лизоцим-подобной активностью (Powning and Davidson, 1973; Jarosz, 1979; Hoffmann et al., 1981). Аналогичные лизоцим-подобные белки были найдены в гемолимфе личинок других видов чешуекрылых. Вторым типом неспецифических антимикробных факторов, содержащихся в гемолимфе личинок большой восковой моли, являются стабильные, относи-
9
тельно низкомолекулярные вещества небелковой природы, не способные лизировать бактериальные клетки, но обладающие бактерицидным действием (Stephens and Marshall, 1962; Hink and Briggs, 1968).
1.1.2. Стероидные гормоны и у-аминомаслянная кислота в личинках Galleria mello- nella
В личинках большой восковой моли обнаружены четыре формы экдистероидов: экди- зон, 20-гидроксиэкдизон (экдистерон), 3-эпи-экдизон и 3-эпи-гидроксиэкдизон (Hsiao and Hsiao, 1979). Исследована динамика изменения титра гормонов в процессе развития насекомого (Bollenbacher et al., 1978; Sehnal et al., 1981; Plantevin et al, 1984). На всех стадиях развития в теле и гемолимфе насекомого преобладают экдистерон и экдизон. Содержание экдистероидов в теле и гемолимфе личинок большой восковой моли повышается перед линьками и достигает максимальной величины (0,8 мкг/г веса личинок и 3 мкМ в гемолимфе) перед метаморфозом. Наибольшее количество гормонов (74 мкг/г) обнаружено в яйцах насекомого (Hsiao and Hsiao, 1979).
Гемолимфа большой восковой моли содержит значительное количество у- аминомасляной кислоты. В процессе личиночного развития тигр у-аминомасляной кислоты претерпевает циклические изменения в интервале концентраций от 1 • 10-3 до 1-1 (Г4 М. Эти колебания связаны с изменением уровня стероидных гормонов в гемолимфе и периодической линькой личинок. Максимальное содержание у-аминомасляной кислоты в гемолимфе (9-1(Г4М) совпадает в периодами пониженной двигательной активности насекомого (Jungreis et al., 1980).
1.2. Биологически активные вещества в продуктах жизнедеятельности пчел
Экологические взаимоотношения растений и обитающих на них насекомых регулируются при помощи разнообразных химических соединений, продуцируемых растениями. В роли таких регуляторов, как правило, выступают вторичные метаболические вещества, чрезвычайно разнообразные по своей химической структуре и проявляемой биологической активности. Многие насекомые способны избирательно накапливать и использовать растительные флавоноиды, алкалоиды и терпены (Харборн, 1985). Медоносная пчела Apis mellifera является насекомым, наиболее активно запасающим вторичные метаболические вещества растительного происхождения. Поскольку личинки большой восковой моли в процессе развития поглощают значительные количества перги, прополисованного пчели- 10
ного воска и меда, в данном разделе мы приведем краткий обзор биологически активных соединений, обнаруженных в этих продуктах жизнедеятельности пчел.
В настоящее время все продукты пчеловодства используются в медицинской практике. Широко известна питательная и терапевтическая ценность меда. Цветочная пыльца, собранная пчелами, и перга используются для лечения энтероколита, колитов, диабета, атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний и анемии. Наиболее перспективным с терапевтической точки зрения продуктом пчеловодства является прополис. Препараты прополиса обладают гипотензивным и сосудорасширяющим действием и используются в медицинской практике для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы (изменения в сосудистой стенке, нарушения кровообращения и пермеабильности сосудов). Прополис оказывает влияние на гормональный статус организма и обладает разносторонним антибиотическим действием. Препараты прополиса положительно зарекомендовали себя при лечении туберкулеза (Апитерапия, 1982).
1.2.1. Ферменты
Мед, перга и прополис являются продуктами совместной деятельности пчел и растений. В ходе сбора с растений и последующей обработки-нектар, цветочная пыльца, смолистые выделения растительных почек и другие предшественники претерпевают значительные изменения. В этих процессах принимает участие целый ряд ферментов.
Наиболее полно изучены ферменты пчелиного меда. Основными ферментами, содержащимися в пчелином меде,4 являются а- и р-амилазы, а-глюкозидаза и глюкозооксидаза. Кроме этого, мед содержит пероксидазу, каталазу, протеазу, кислую фосфатазу и эстеразу (White, 1975; Ivanov, 1981). Часть этих ферментов секретируется в мед пчелами, другие имеют растительное происхождение (Bergner and Diemair, 1975; Bergner and Sabir, 1979). Ферменты меда обладают стабильностью при длительном хранении. Амилаза, а- глюкозидаза, кислая фосфатаза и эстераза проявляют также и значительную термостабильность (Ivanpv, 1981; Malaiu et al., 1979). В электрофоретически-гомогенном виде были выделены две а-глюкозидазы меда. Они оказались гликопротеинами с молекулярной массой 54000 и 73000 дальтон, содержащими маннозу и галактозу (Takenaka and Echigo, 1978).
Кислая фосфатаза, а- и (3-амилаза обнаружены в перге (Standifer et al., 1980). Стабильные а- и р-амилазы, не денатурирующие под действием 96% этанола, были экстрагированы из прополиса (Kaczmarek and Debowski, 1983).
11
1.2.2. Антибиотические вещества
Антибиотические факторы присутствуют во всех продуктах жизнедеятельности пчел. В наибольших количествах они содержатся в прополисе. Пчелы собирают прополис с пазушных почек деревьев и некоторых травянистых растений и используют его для дезинфекции и герметизации улья. Химический состав и биологическая активность прополиса зависят от его растительного источника и географического происхождения. Основными источниками прополиса, собираемого пчелами в России и Западной Европе, являются смолистые выделения пазушных почек березы и тополя (Поправко и др., 1981).
Спектр антибиотической активности прополиса очень широк. Препараты прополиса подавляют рост грам-положительных бактерий (Поправко и др., 1981: Olivieri and Ginossi, 1981), стафилококков (Meresta and Meresta, 1980; Глинник и Гопанович, 1981; Szewczak et al., 1984), дрожжевых и плесневых грибков (Olivieri and Ginossi, 1981; Cizmarik and Trupl, 1976; Metzner et al., 1977), туберкулезных бактерий (Jozwik and Baraniecka-Wloszycka, 1976), трихомонад (Starzyk et al., 1977), эффективны против вирусных инфекций (Esanu et al., 1981) и оказывают цитостатическое действие на культуры трансформированных клеток млекопитающих (Hladon et al., 1980; Ellnain-Wojtaszek et а1.,Л982; Ban et al., 1983).
Антибиотическое действие прополиса в основном обусловлено его флавоноидными компонентами. Антимикробной активностью обладают флавоноиды акацетин, эрмапин и пектолинарингенин (Поправко и др., 1981), флавонолы галангин, изальпинин и их производные, рамноцитрин и кемпферид (Поправко, 1972), флаваноны пиноцембрин, пиносро- бин и его производные (Поправко, 1972: Schneidewind et al., 1975; Metzner et al., 1979), пи- нобланксин-3-ацетат (Schneidewind et al., 1975). Антимикробной активностью также обладают входящие в состав прополиса соединения гликозидной природы (Поправко и др., 1981), производные кумаровой, феруловой и кофейной кислот (Schneidewind еу al., 1975; Поправко и др., 1984; Чижмарик и Мател, 1981), а также бензоат транс-кониферилового спирта, являющийся основным компонентом смолы росного ладана (Поправко и др., 1984).
Фунгидными свойствами обладает входящий в состав прополиса флаванон пиноцембрин (Cizmarik and Trupl, 1976), а флавон кверцетин проявляет антивирусную активность (Esanu etal., 1981).
Цитостатическое и цитотоксическое действие на культуры трансформированных клеток млекопитающих оказывают галангин, кверцетин, рамнетин и несколько других соединений флавоноидной природы (Hladon et al., 1980; Ellnain-Wojtaszek et al., 1982).
12
Флаваноны и ацетат-бетуленола, содержащиеся в прополисе, оказывают ингибирую- щее влияние на прорастание семян и рост растений (Поправко и др., 1981).
Антимикробные свойства меда обусловлены вырабатываемой глюкозооксидазой перекисью водорода, а также присутствием стабильных ингибинов, из которых идентифицирован флаванон пиноцембрин (Bogdanov, 1984).
1.2.3. Гормоны и медиаторы
Пчелы, как и другие насекомые, продуцируют ряд гормонов, функционально и структурно идентичных эндогенным гормонам млекопитающих. Некоторые из них секретиру- ются в производимые пчелами продукты. Ацетилхолин секретируется пчелами в мед и маточное молочко, где его концентрация соответственно составляет 7,6-45,7 и 500-1500 мкг/мл (Abdel-Wahab et al., 1979; Valente et al., Д981). Норадреналин в свободной и конъю- гированной форме присутствует в составе меда (менее 20 и 40 нг/г соответственно) (Le- comte et al., 1976). Свободный и конъюгированный норадреналин обнаружен также в вощине. Повышенный уровень норадреналина характерен для вощины, содержащей личиночные покровы расплода пчел. Предполагается, что норадреналин секретируется в воск слюнными железами пчел, а также аккумулируется в вощине по мере роста и развития личинок пчел (Bourdon et al., 1977).
Пчелы продуцируют инсулин, иммунологически и функционально близкий к инсулину млекопитающих. Показано присутствие инсулина в маточном молочке и корме личинок рабочих пчел (Dixit and Patel, 1964; Kramer et al., 1977; 1982).
Другим источником гормонов может служить пыльца растений. В пыльце некоторых растительных видов обнаружены эстрон (Bennet et al., 1966; Kvanta, 1968), тестостерон, эпистерон и андростенедион (Saden-Krehula et al., 1971), эпитестостерон, прогестерон и 17а-гидроксипрогестерон (Saden-Krehula et al., 1976). В пыльце, собираемой пчелами, показано присутствие биологически активного экдистероида ситостерина (Farag et.al., 1980), а также обнаружено значительное количество у-аминомасляной кислоты (Ionescu and Ga- ragiani, 1977).
1.2.4. Витамины
Богатым источником витаминов является цветочная пыльца. В 100 г пыльцы содержится 0,6 мг тиамина, 1,67 мг рибофлавина, 0,9 мг пиридоксина, 2,7 мг пантотеновой кислоты и 10 мг никотиновой кислоты. Значительное количество витамина А присутствует в пчелином воске (Апитерапия, 1982).
13
Некоторые химические соединения, содержащиеся в продуктах жизнедеятельности пчел, проявляют множественную биологическую активность. Например, флаваноны пи- ноцембрин, пиностробин, и эфиры кофейной кислоты, подавляющие рост микроорганизмов, оказывают местное анестезирующее действие в организме млекопитающих (Paintz and Metzner, 1979). Флавон кверцетин, помимо уже упоминающегося антивирусного и ци- тостатического действия, обладает Р-витаминной активностью (Шамрай и Федуров, 1968), а также способен модулировать активность ряда мембранносвязанных и цитоплазматиче- ских ферментов млекопитающих (Laychock, 1986).
Имеющиеся в настоящее время сведения о химическом составе и биологической активности продуктов жизнедеятельности пчел носят фрагментарный характер. Выше обсуждались только те идентифицированные компоненты перги, прополиса, меда и пчелиного воска, для которых установлен какой-либо вид биологической активности. Кроме веществ, рассмотренных выше, в составе этих продуктов обнаружено большое количество различных химических соединений, сведения о биологической активности которых отсутствуют.
Глава 2. СТЕРОИДНЫЕ ГОРМОНЫ НАСЕКОМЫХ И ИХ ДЕЙСТВИЕ В ОРГАНИЗМЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Процессы развития и метаморфоза насекомых контролируются двумя основными семействами эндогенных гормонов: экдистероидами и ювенильными гормонами. Физиологическая функция ювенильных гормонов состоит в продлении личиночной стадии развития насекомого, тогда как периодическое высвобождение в гемолимфу экдистороидов обусловливает прохождение личинкой серии возрастных линек с последующим превращением в имаго (Тыщенко, 1986).
Ювенильные гормоны насекомых относятся к классу терпеноидных соединений. Соединения терпеноидной и иной химической природы, обладающие ювенильной активностью, довольно широко распространены в природе. ЮвениЛьные гормоны и их аналоги
продуцирцются многими видами растений, вещества, обладающие ювенильной активно-
<j
стью, обнаружены в различных пищевых продуктах, микроорганизмах, тканях беспозвоночных и позвоночных животных (Slama, 1974), млекопитающих и человека (Gilbert and Schneiderman, 1958; Williams et al., 1959). Ювенильные гормоны и их аналоги вызывают специфические тканевые, органные и клеточные реакции у насекомых различных видов (Riddiford, 1985). Показано, что ювенильный гормон способен влиять на проводимость искусственных бислойных липидных мембран (Baumann, 1969). Тем не менее, ювениль- 14
ные гормоны не проявляют физиологической и фармакологической активности в организме млекопитающих (Slama, 1974).
Экдистероидные гормоны насекомых представляют собой полигидроксилированные стерины, хорошо растворимые в воде и водно-спиртовых смесях. В настоящее время из насекомых выделено и идентифицировано около двадцати экдистероидов различной химической структуры. Наиболее широко распространенными и физиологически важными из них являются экдистерон и экдизон (Horn and Bergamasco, 1985). Действие экдистероидов в организме насекомых проявляется на всех уровнях биологической организации. Эк- дистероиды регулируют экспрессию генов, биосинтез белка, митогенную и морфогенную активность органов и тканей, влияют на развитие и активность нервной системы, и поведение насекомых (Riddiford, 1985; O'Connor, 1985).
В 1966 году экдистероиды были впервые обнаружены в растениях (Nakanishi et al.,
1966). К настоящему времени экдистероиды найдены в нескольких десятках видов расте-
—3 ___ i
ний, как вечнозеленых и папоротниках, так и цветковых, в количествах (1-10 -1-10 % от сухого веса), значительно превышающих их содержание в организме насекомых (ЫСГ9- 1-1(Г5%). Фитоэкдистероиды обладают большим химическим ^разнообразием, чем экдистероиды животного происхождения. Известно около семидесяти фитоэкдистероидов установленного химического строения, из которых наиболее широко распространенным и обнаруживаемым в наибольших количествах является экдистерон (Холодова, 1979: Horn and Bergamasco, 1985). Обнаружение экдистероидов в растениях сделало доступными для исследователей коммерческие препараты этих горомонов. То обстоятельство, что некоторые из растений, продуцирующих экдистероиды, издавна используются в терапевтических целях (Uchiyama and Otaka, 1972; Сыров и Курмуков, 1977), стимулировало исследования биологического действия этих гормонов на млекопитающих.
В 1963 году Бурдетте и Кода (Burdette and Coda, 1963) обнаружили, что экдистероид- ный экстракт, полученный из тутового шелкопряда, стимулирует включение 14С-лейцина в белки печени мышей. В последующих работах было показано, что введение экдистерона и других экдистероидов млекопитающим вызывает усиление биоситенза белка в печени, сердце и скелетных мышцах (Uchieama and Otaka, 1974; Сыров и др., 1975; Сыров и Курмуков, 1976; Айзиков и др., 1978). Активация белкового синтеза в организме млекопитающих является результатом непосредственного воздействия экдистероидов на рибосо- мальный синтез белка (Uchiyama and Otaka, 1974; Сыров и др., 1978) и обусловлена повышением функциональной активности полирибосом, по-видимому, за счет сопряженной
15
стимуляции инициации транскрипции и элонгации полипептидных цепей (Сыров, 1984). Обнаружена также стимуляция синтеза РНК в тканях мышей под действием экдистерона (Uchiyama and Otaka, 1974). Сравнительное изучение действия экдистерона и других экди- стероидов, неробола, 4-хлортестостерона, и других анаболических стероидов показало, что по многим параметрам биологической активности экдистероиды близки к анаболическим стероидным препаратам (Uchiyama and Otaka, 1974; Сыров и Курмуков, 1975; Айзи- ков и др., 1978). Активация белкового синтеза под действием экдистероидов соцровожда- ется усиленным накоплением гликогена в печени, миокарде и скелетных мышцах млекопитающих (Сыров и др., 1975; Айзиков и др., 1978; Маликов и др., 1982).
Рядом авторов исследовалось влияние экдистероидов на процессы утилизации глюкозы у млекопитающих. Было показано, что экдистерон и инокостерон, не влияя на нормальный уровень сахара в крови, обладают способностью йодавлять искусственно вызванную гипергликемию (Yoshida et al., 1971; Ogawa et al., 1974). Снижение уровня глюкозы в крови под действием экдистерона сопровождается усилением ее включения в гликоген печени (Uchiyama and Yoshida, 1974). Влияние экдистероидов на утилизацию глюкозы у млекопитающих осуществляется через модуляцию активности ферментов углеводного обмена (Uchiyama and Yoshida, 1974; Ташмухамедова и др., 1982).
В 1969 году Люпен с соавторами обнаружили, что введение экдистерона крысам приводит к выраженному снижению содержания холестерина в печени (Lupien et al., 1969). В последующие годы гипохолестеринемическое действие экдистерона и других экдистероидов было подробно исследовано рядом авторов на различных лабораторных моделях. Было показано, что экдистерон снижает уровень холестерина в крови кроликов с экспериментальным атеросклерозом (Matsuda et al., 1974) и уменьшает уровень холестерина в сыворотке крови, мембранах эритроцитов и микроворсинках клеток кишечника крыс, содержащихся на диете, вызывающей гиперхолестеринемию (Миронова и др., 1982). Гипохолестеринемическое действие экдистероидов обусловлено подавлением биосинтеза холестерина (Uchiyama and Yoshida, 1974) и торможением его всасывания в кишечнике (Иоффе, 1984). Гипохолестеринемическая активность экдистероидов зависит от их химической структуры и усиливается с увеличением количества окси-групп в молекуле. Наиболее активными гипохолестеринемическими агентами являются 1-оксиэкдистерон и экдистерон (Миронова и др., 1982).
В серии работ, проведенных Каталаном с сотрудниками, исследовалось влияние экдистерона на содержание циклических нуклеотидов и протеинкиназную активность в различных тканях мышей. Было показано, что введение экдистерона вызывает снижение
16
уровня цАМФ, уменьшение активности цАМФ-зависимой протеинкиназы и цАМФ- связывающего белка в различных тканях и сыворотке крови мышей, а также уменьшает содержание цАМФ в сыворотке крови и печени мышей в условиях in vivo (Catalan et al., 1979a; 1979в; 1982a). Аналогичные результаты были получены в опытах in vitro (Catalan et al., 1982в). Авторы приходят к выводу о том, что действие экдистерона в организме млекопитающих может осуществляться через цАМФ-зависимую протеинкиназную систему.
Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные свидетельствуют о том, что экдистероиды оказывают глубокое и разнообразное по своему характеру воздействие на организм млекопитающих, для которых они не являются эндогенными гормонами. Попытки выделить из тканей млекопитающих соединения, обладающие экдизисной активностью в тестах на насекомых, не увенчались успехом (Burdette, 1962; 1974а). Для объяснения высокой биологической активности экдистероидов в организме млекопитшо-щих бы-., ла выдвинута концепция гормональной гетерофилии, предполагающая наличие-эволюции онно общих межвидовых механизмов гормонального действия (Burdette, 1974а). Предпо? , , латается, что гетерофильное действие экдистероидов является следствием их структурно- ■ го сходства со стероидными гормонами млекопитающих (Uchiyama and Otaka, 1974). Вместе с тем, гетерофильное действие экдистероидов не является гормональным в истинном смысле этого слова и носит скорее фармакологический характер (Slama, 1974).
Наиболее ярко действие экдистероидов в организме млекопитающих проявляется в условиях патологии. Помимо уже обсуждавшихся антигипергликемического и гипохоле- стеринемического эффектов экдистероидов, в качестве примера можно привести усиление репаративной регенерации печени при токсическом гепатите (Сыров и др., 1981) и стимуляцию эритропоэза в условиях экспериментальной анемии (Сыров и Курмуков, 1977) под действием экдистероидов. В опытах на ишемизированном миокарде кроликов и крыс было продемонстрировано мембраностабилизирующее действие экдистерона (Гримова и др., 1977). Аналогичные результаты были получены в экспериментах на эритроцитах кроликов (Гримова и др., 1977; Холодова, 1979). Показано, что экдистероиды оказывают положительное влияние на энергетический обмен в условиях патологии. Введение экдистерона и туркестерона крысам с аллоксановым диабетом устраняет патологическую активацию окислительного фосфорилирования в митохондриях печени, выявляемую при этом заболевании (Ташмухамедова и др., 1985) и нормализует активность ряда митохондриальных ферментов печени крыс с экспериментальным гепатитом (Ташмухамедова и др., 1986). Имеются свидетельства о том, что экдистероиды оказывают значительное адаптогенное,
17
тонизирующее и антиневралгическое действие на млекопитающих и человека (Hikino and Takemoto, 1972; Сыров и Курмуков, 1977).
Вопрос о фармакологической ценности экдистероидов заслуживает пристального внимания исследователей. С фармакологической точки зрения, действие экдистероидов имеет ряд положительных сторон. Токсичность этих соединений для млекопитающих чрезвычайно низка (Matsuda et al., 1970; Ашрафова и Сыров, 1979). Анаболическое действие экдистероидов не сопровождается андрогенными эффектами и патологическими изменениями в органах и тканях подопытных животных (Masuoka et al., 1970; Ogawa et al., 1974; Сыров и Курмуков, 1976). В настоящее время в отечественной медицине используется препарат естественного продуцента фитоэкдистероидов - мараль -его корня, адапто- генные и тонизирующие качества которого.обусловлены экдистероном (Сыров и Курмуков, 1977).
Таким образом, экдистероиды являются новой группой биологически активных веществ природного происхождения, оказывающих многогранный эффект.
Глава 3. СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТАЯ СИСТЕМА КАК ТЕСТ-МОДЕЛЬ ПОИСКА НОВЫХ СРЕДСТВ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНЕЙ СЕРДЦА
В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания, и в первую очередь ишемиче- ские болезни сердца (ИБС) продолжают оставаться ведущей причиной смертности в большинстве развитых стран. Согласно приводимым в последнее время данным, примерно в 60% случаев ИБС клинически проявляется острым коронарным синдромом, в 24% - стабильной стенокардией, в остальных 16% случаев - ВСС (внезапная сердечная смерть). Однако, несмотря на значительные усилия, прилагаемые для ее решения на протяжении последних 20 лет достигнуть значительных успехов в вопросах прогноза, терапии и профилактики ВСС и хронической сосудистой недостаточности так и не удалось. Появилась необходимость пересмотреть методологию лечения, так внимание кардиологов мира переместилось с гемодинамической, теории лечения патогенеза сердечно-сосудистых болезней на нейроэндокринную. Согласно этой модели активация ренин-ангиотензин- альдостероновой системы (РААС) и симпатической нервной системы - одно из кардинальных патофизиологических нарушений у больных с сердечной недостаточностью. ХСН, в настоящее время рассматривается как синдром, развивающийся при нарушении нейроэндокринной регуляции и представляющий собой комплекс циркуляторных реакций, вследствие систолической или диастолической кардиальной дисфункции.
18
Среди современных средств фармакотерапии в лечении патогенеза сердечной недостаточности пригодны в настоящее время следующие группы препаратов: ИАПФ, Р- адреноблокаторы, антагонисты альдостерона, периферические вазодилататоры, диуретики, СГ, негликозидные инотропные средства, препараты метаболического действия.
ИАПФ - ингибиторы ангиотензин превращенных ферментов - наиболее эффективны либо в виде монотерапии, либо в комбинации с другими средствами. ИАПФ - замедляют прогрессирование застойной сердечной недостаточности, снижая летальность и увеличивая продолжительность жизни больных с ХСН.
Механизм действия ИАПФ включает в себя снижение нейрогуморальных, вазоконст- рикторного и антидиурического звеньев и усиление вазодилатирующего компонента: расширение периферических сосудов, снижение пред- и пост нагрузки на сердце, снижение артериального давления и урежение частоты сердечных сокращений (ЧСС), увеличение сократит способности миокарда и сердечного выброса, улучшение диастолического наполнения желудочков, антиаритмический эффект^улучшение функции эндителия и про- тивоишемический эффект.
Антагонисты альдостерона - снижают реадсорбцию Ыа в почках, кишечнике, слюнных железах, препятствуют образованию фибробластов и развитию интерстициального фиброза, улучшают электрическую стабильность миокарда.
Изменение взгляда на патогенез ХСН привело к пересмотру возможностей использовать Р-адреноблокаторов. Они могут приводить к регрессу дилатации левого желудочка или хотя бы замедлять ее развитие. Возможный механизм действия Р-адреноблокаторов при ХСН следующий: замедление деятельности сердца, улучшение контрактильного синхронизма, профилактика токсического действия катехоламинов на миозиты, регуляция функции Р-адренорецепторов, вмешательство в несимпатические гуморальные, пара- и аутокринные механизмы стимуляции, антиаритмический эффект, улучшение миокарди- альной биоэнергетики. При этом уменьшается переполнение кардиомиозитов Са, улучшается диастолическая функция сердца. Вследствие отрицательного инотропного и хроно- тропного действия р-адреноблокаторов снижается потребление миокардом йислорода, что на фоне усиления коронарного кровотока приводит к улучшению перфузии миокарда.
Сердечные гликозиды - занимают достойное место среди сердечных препаратов. К их преимуществам относится положительное инотропное действие, подавление активности нейрогуморальной системы, снижение миокардом потребления кислорода.
19
Однако сердечные гликозиды, обладают узким диапазоном терапевтического действия, поэтому следует использовать невысокие дозы, учитывая индивидуальную чувствительность больных.
Среди негликозидных инотропных средств различают: ингибиторы фосфодиэстерозы (омрипон, милринон), стимуляторы p-адренорецепторов (добутамин, ибопомин), сенсибилизаторы Са эти препараты должны применяться короткими курсами.
Среди средств комбинированной терапии ХСН используют периферические вазодиля- таторы, диуретики.
Все рассмотренные современные фармакотерапевтические средства, на сегодняшний день, не снижают проявлений заболеваний сердца, а способствуют поиску новых лекарственных препаратов, повышающих толерантность к физическим нагрузкам, стрессу, улучшению качества жизни, используя средства народной медицины, которые подходят для профилактики сердечно сосудистых заболеваний, и коррекции адаптационных возможностей человека.
В данной работе представлено исследование старинного народного средства экстракта из большой восковой моли Gallerнa mellonella, как средства обладающего кардиопротек- торными свойствами.
20
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава. 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Выращивание личинок Galleria mellonella и экстракция биологически активных веществ
Большую восковую моль Galleria mellonella L. Собирали в Московской области. Личинок большой восковой моли выращивали в лабораторных условиях в темноте при 25 - 30°С и 80% относительной влажности на естественном корме (темная восковая сушь, содержащая пергу, прополис и остатки меда). В работе использовали личинок весом 150 мг и более, находящихся на последних стадиях развития перед окукливанием.
Экстракцию биологически активных веществ из личинок проводили 40% этанолом (450 мл 40% этанола на 100 г личинок) без гомогенизации при комнатной температуре в темноте в течение 20 дней, по методу, применяемому в народной медицине и гомеопатии. Полученный экстракт хранили в темноте при 4°С.
Экстракт личинок большой восковой моли, вырещенных на искусственной питательной среде (содержащей 8% очищенного воска и 10% меда) (Кузнецова, 1981). Продукты пчеловодства: образцы меда^аточного молочка, прополиса, перги (цветочная пыльца, перерабатываемая и запасаемая пчелами) и неочищенного пчелиного воска (темная восковая сушь), получали с пасек Московской области. Комерческий образец полифлорной цветочной пыльцы-обножки получали из Прибалтики (ЛатвССР). Экстракцию биологически активных веществ из сухих продуктов пчел проводили 96% и 40% этиловым спиртом и водой (вес:объем=1:5) при комнатной температуре в течение суток. Маточное молочко (апилак) и мед растворяли непосредственно в инкубационных средах.
4.2. Выделение и очистка биологически активных компонентов экстракта личинок Galleria mellonella
Экстракт личинок вдсковой моли концентрировали на вакуумном роторном испарителе. Для удаления липидов экстракт последовательно обрабатывали 4 раза смесью хлоро- форм:метанол (2:1) (3 объема смеси хлороформ:метанол на 2 объема экстракта) и 6 раз диэтиловым эфиром (4 объема диэтилового эфира на 3 объема экстракта). После этого водную фазу концентрировали на вакуумном роторном испарителе, добавляли равный объем этанола и центрифугировали (К-24,15000 об/мин, 30 мин). Супернатант подвергали гель-хроматографии на колонке с сефадексом LH-20 ("Pharmacia Fine Chemicals")- Элю- 21
цию проводили 50% этанолом. Высокомолекулярную фракцию I-LH-20 высушивали на вакуумном роторном испарителе, сухое вещество промывали смесью хлороформ :метанол (2:1) и 96% этанолом, растворяли в бидистиллированной воде, добавляли равный объем этанола и подвергали гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-50 medium ("Pharmacia Fine Chemicals). Элюцию проводили 50% этанолом. Низкомолекулярную фракцию 3-G-50 высушивали на вакуумном роторном испарителе, сухое вещество промывали смесью хлороформ:метанол (2:1) и 96% этанолом, растворяли в 20 мМ Трис-HCl буфере (рН 8,0) и подвергали ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ сефадексом А-25 ("Pharmacia Fine Chemicals). Элюцию проводили линейным градиентом 0-0,7 М КС1 в том же буфере. Выделенную таким образом биологически активную фракцию 7-А-25 концентрировали на вакуумном роторном испарителе, обессоливали гель-хроматографией на колонке с сефадексом LH-20 и лиофилизовали.
Выделение щелочной сериновой протеазы. Фракцию I-G-50, содержащию щелочную протеазу, выделяли последовательно гель-хроматографией экстракта на колонках с сефа- дексами LH-20 и G-50 medium, без предварительной делипидизации экстракта.
Для определения молекулярных масс использовали наборы белков-маркеров с известными молекулярными массами LMW Calibration Kit ("Pharmacia Fine Chemicals) и PTM № 5 ("Serva").
Электрофорез в кислой буферной системе (рН 4,3) проводили в градиентном полиак- риламидном геле (5-20% ПААГ) по методу Рейсфельда (Reisfeld et al., 1962). Электрофо- реграммы окрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250.
Тонкослойную хроматографию1 проводили на стеклянных пластинках (13x18 см), покрытых силикагелем Н ("Merck"), в следующих системах растворителей: н-бута- нол:уксусная кислота:вода (4:1:1) и н-пропанол:вода (7:3). Длина пробега фронта растворителя составляла 10 см (Кирхнер, 1981).
Для выявления компонентов экстракта личинок восковой моли хроматограммы окрашивали реагентами, специфичными для различных видов органических соединений:
азотнокислое серебро («Реахим») - сахара, фенолы и др.соед. (Вальди, 1965);
а-нафтол ("Chemapol")-/углеводы (Мацек, 1962);
анисовый альдегид ("Chemapol") - сахара, простагландины;
нефторезорцин ("Chemapol") - углеводы;
нингидрин ("Chemapol") - аминокислоты;
тетраазотированный ди-о-анизидин ("Chemapol") - фенолы;
фосфомолибденовая кислота ("Реахим") - липиды, стероиды (Кирхнер, 1981).
22
! Работу проводили совместно с С.П.Волковой (ИБФ РАН).
Количественное определение белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Калибровочную кривую для определения белка строили по бычьему сывороточному альбумину ("Sigma").
Проба на протеолитическую активность. Тестируемые вещества в концентрациях 50-500 мкг/мл растворяли в 50 мМ Трис-HCl буфере (рН 7.2), содержащем 3 мг/мл БСА ("Sigma"). Образцы инкубировали в течение 20 часов при 37°С и затем подвергали диск- электрофорезу в 5-20% ПААГ в щелочной буферной системе Дэвиса (Davis, 1964). Элек- трофореграммы лкрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250. О наличии и степени протеолиза судили по изменению числа и интенсивности белковых полос на электрофоре- граммах. Для сравнения протеолитического действия ставили пробы с трипсином ("Spofa") и пепсином ("Boehringer").
Количественное определение протеолитической активности. Протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона (Anson, 1939) с использованием БСА в качестве субстрата. Реакцию проводили в 0,1 M глицин-NaOH буфере (рН 11,0), содержащем 1% БСА ("Serva") и 45-80 мкг/мл ферментного препарата. После 4- часовой инкубации при 30°С в реакционную смесь вносили 2-х кратный объем 15% три- хлоруксусной кислоты, выдерживали пробы 2 часа при комнатной температуре, центрифугировали (К-24, 10000 об/мин, 20 мин) и измеряли оптическую плотность супернатанта при 278 нм. Калибровочную кривую строили по тирозину («Реахим»), Протеоличискую активность выражали в микромолях тирозина, высвобожденного под действием 1 мг ферментного препарата в 1 мл реакционной смеси за 1 минуту, или в процентах по отношению к контролю.
Определение молекулярной массы протеазы. Ферментный препарат подвергали диск-электрофорезу в 5-20% ПААГ в щелочной буферной системе Дэвиса (Devis, 1964). По окончании электрофореза гель разрезали на секции толщиной 2 мм, помещали в пробирки и гомогенизировали в 0,1 M глицин-HCl буфере, содержащем 1% БСА (1 мл раствора БСА на секцию в каждой пробирке). Гели-дубликаты окрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250, как описано выше. Для калибровки использовали набор белков- маркеров с известной молекулярной массой LMW Calibration Kit ("Pharmacia Fine Chemicals).
Исследование влияния ингибиторов на протеолитическую активность. Ферментный препарат растворяли в 0,1 M глицин-NaOH буфере (рН 11,0) или 0,1 M Трис-HCl буфере (рН 7,5) в концентрации 1 мг/мл и инкубировали при 30°С в течение 30 мин с раз- 23
личными ингибиторами. После этого определяли остаточную протеолитическую активность модифицированным методом Ансона, как описано выше. В работе использовали следующие ингибиторы: ингибиторы сериновых ферментов
диизопропил фторфосфат (DFP, "Serva"), (Cohen et al., 1967) фенилметилсульфонил фторид (PMSF, "Serva"), (Gold, 1967) ингибитор трипсина из белка куриных яиц (овомукоид, "Boehringer") ингибиторы тиоловых ферментов пара-хлормеркурийбензоат (РСМВ, "Chemapol") N-этилмалеимид (NEM, "Chemapol"), (Riordan and Vallee, 1967) Ингибиторы металлсодержащих ферментов
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА, «Реахим»), (Антонов, 1983).
4.3. Изучение химического состава биологически активных компонентов
Исследование влияния ионов двухвалентных металлов на протеолитическую активность. Ферментный препарат растворяли в 0,1 М глицин-NaOH буфере (pH 11,0) в концентрации 1 мг/мл и инкубировали в присутствии солей двухвалентных металлов при 30°С в течение 30 минут. После этого определяли остаточную протеолитическую активность, как описано выше. В работе использовали следующие соли: MgCl2, СаСЬ, C0CI2, NiCli, ZnCl2, CdCl2, ВаС12, HgCl2 («Реахим»), категории "хч" или "осч".
Исследование тормостабильности протеазы. Ферментный препарат растворяли в бидистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл и инкубировали при различных температурах в течение 30 мин, затем определяли протеолитическую активность, как описано выше.
' Исследование влияния органических растворителей на протеолитическую активность. Раствор ферментного препарата в бидистиллированной воде (1 мг/мл) встряхивали с 1,5- кратным объемом смеси хлороформ:метанол (2:1) или диэтилового эфира в течение 5 минут. После этого пробы испаряли под вакуумом досуха, растворяли ферментный препарат в 0,1 М глицин-NaOH буфере в исходной концентрации и определяли остаточную протеолитическую активность, как описано выше.
В работе по исследованию биохимических свойств щелочной сериновой протеазы использовали глицин фирмы "Reanal" и трис-(гидроксиметил)-аминометан фирмы "Serva".
24
Глава 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Физиологические эксперименты проведены на крысах линии Wistar, частично на клеточных культурах лимфобластоидных клетках человека линии Raji и кроликах.
5.1. Изучение сократительной активности сердца и гладких мышц миометрия и сосудов
Сократительную активность сердца проводили на папиллярных мышцах правого желудочка, а также на спонтанно сокращающихся предсердиях (ушках) крысы с помощью механотрона (датчика силы) марки 6МХ2Б, в изометрическом режиме (Браунвальд с со- авт., 1974) и термостатируемой камере при температуре 35-37°С, с проточным физическим раствором Тирроде, содержащим: 132 мМ NaCl, 4.5 мМ KCl, 11 мМ NaHC03, 0,25 мМ MgCl2, 2,11 мМ СаС12, 11 мМ глюкозы, раствор оксигенировали смесью СО2 (5%)+02 (95%) при рН=7,4.
Для изучения сократительной активности гладких мышц использовали спиралеобразные препараты из сосудистой ткани аорты, шириной около 2 мм и длиной около 5 мм, прилагаемая нагрузка 0,5 г (варьирует от длины препарата) измерение велись в изометрическом режиме датчиком силы марки: 6МХ1С. Физиологический раствор Кребса- Хенсеиейта имел следующий состав в мМ/литр: NaCl - 118, KCl - 4.7, CaCh - 2.52, MgS04 - 1.64, NaHC03 - 24.88, KH2P04 - 1,18, глюкоза - 5.55, аэрируемый смесью C02 (5%+02 (95% при рН=7ю4, и температурой раствора 27°С.
Сократительную активность миометрия изучали на половозрелых крысах-самках, в изометрическом режиме при температуре +29°С.
Датчиком силы служил механотрон марки 6МХ2Б (Р.Блатнер и соавт., 1982). Для подавления спонтанной активности мышц миометрия, животным за 24 часа до эксперимента вводили препарат диэтильстильбестрол из расчета 0,2-0,3 мл 3% маслян-ного препарата на 100 гр веса животного. Сократительную активность выражали в процентах по отношению к максимальному ответу мышц, вызываемому агонистами: ацетилхолином, серото- нином, или же 30 мМ KCl (вызывающему деполяризацию мышц - в случае с миометрием) или же^ при спонтанных сокращениях сердечных препаратов, к собственному фоновому уровню сократительного ответа.
Искусственную, тотальную ишемию миокарда моделировали посредством полного прекращения подачи перфузионного раствора на 30 минут, затем возобновлением перфузии с той же скоростью до полного восстановления работы сердца.
25
5.2. Изучение энергетического обмена в сердце крысы
Оценку уровня активации энергетического метаболизма в сердце^при длительном курсовом (25 дней) введении экстракта животным^роводили на митохондриях сердца.
Для этого сердце животного (крысы) охлаждали в среде выделения, содержащей: 320 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 0,2% бычьего сывороточного альбумина ("Sigma") и 10 мМ трис-HCl буфере (рН=7.2), в течение 7-10 мин. При 0°С, перфузировали охлажденной средой выделения, измельчали ножницами и гомогенизировали в гомогенизаторе Ахмерова в течение 30-40 с.
Далее гомогенат центрифугировали в течение 3 мин при 1000 об/мин и 4 мин при 1500 об/мин, затем митохондрии осаждали при 6000 об/мин и разводили средой выделения в соотношении 1:1,5.
Регистрацию параметров дыхания MX проводили полярографическим методом (Коваленко Е.А. и др., 1975), в термостатируемой камере при 25°С. Инкубационные среды содержали: 300 мМ сахарозы, 50 мМ KCl, 1 мМ КН2Р04, 0,5 мМ ЭДТА и 5 мМ трис-HCl буфер (рН=7.2). Скорость дыхания расчитывали на 1 мг белка, определяемого методом Лоури.
5.3. Исследование цитотоксичности проводили с использованием в качестве тест- системы культуры лимфобластоидных клеток человека линии Raji[1]. Исследуемые вещества вносили в среду культивирования одновременно с посевом клеток. Конечную клеточную плотность определяли в гемоцитометре через 3 суток культивирования, когда кривая роста достигала стационарной фазы.
2
Результаты экспериментов обработаны статистически с применением критериев х и критерия t Стьюдента.
26
Глава 6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
6.1. Химическое разделение экстракта восковой моли
В таблице 1 представлен общий химический состав экстракта из восковой моли, выращенный на естественном корме (темная восковая сушь, содержащая пергу, прополис остатки меда) в лабораторных условиях.
Таблица 1. Общий состав экстракта восковой моли
Химическое соединение
Содержание в экстракте (% сухого вещества
Высокомолекулярные вещества
2
Нуклеотиды и нуклеозиды
1,5
Свободные аминокислоты
50-60
Моносахариды и дисахариды
2-4,7
Жирные кислоты
0,1
Минеральные вещества
7,1-9,1
Экстракт из личинок Gallerнa mellonella, представляет собой жидкость темно-бурого цвета, содержащую большое количество свободных аминокислот, моносахаридов и диса- харидов, нуклеотидные основания и их производные, жирные кислоты, биологически важные элементы и микроэлементы (К, Р, Ca, Zn, Mo, Со и др.). Высокомолекулярная фракция экстракта содержит щелочную протеазу и ароматические соединения, связанные с сахарами и аминокислотами. В экстракте присутствуют биологически активные вещества, производимые пчелами, а так же компоненты, стимулирующие сократительную активность гладких мышц и ускоряющие рост клеток и тканей (Спиридонов H.A., Баканева В.Ф., 1992).
Рис. 2. Гель-хроматограмма очистки экстракта большой восковой моли на коллонке с сефадексом LH-2 О
27
6.2. Биохимическая характеристика биологически активных фракций из личинок
Gallerнa mellonella
Наибольший интерес представляет в экстракте высокомолекулярная фракция, которую подвергали дальнейшей очистке на колонке с сефадексом LH-20 и G-50 medium. Идея о том, что личинки восковой моли могут содержать вещества, способные лизировать восковые оболочки туберкулезных бактерий была впервые высказана И.И.Мечниковым. Проведенная нами очистка и скрининг экстракта восковой моли показала, что фракция 1- LH- 20 и 1-G-50 при дальнейшей очистке содержит кислую сериновую протеазу, способную растворять оболочки клеток, вероятно, ей же принадлежит и роль в рассасывании тромбов и бляшек в сосудах и легочной ткани, регенерации рубцовых тканей после инфаркта.
На рис.2 представлена хроматограмма экстракта восковой моли.
7 8 9 10 11 12 13 рН (концентрация) Рис. 3. Зависимость активности протеазы от рН среды
s
"С 2 А
В
О
х а Я
Ё с
6.2.1. Молекулярная масса протеазы
Исследование биохимических свойств протеазы из личинок восковой моли проводили с использованием высокомолекулярной фракции 1-0-50, и распределение протеолити- ческой активности в полиакриламидном геле после электрофореза. В составе данной фракции присутствует несколько белковых компонентов. Единственный максимум протеолитической активности соответствует белковой полосе с молекулярной массой 26000+2000 дальтон. Это дает основание полагать, что фракции 1-0-50 содержит один протеолитический фермент. Некоторое повышение фона протеолитической активности в левой части геля, по-видимому, является результатом взаимодействия протеазы с другими белками в процессе электрофореза.
28
6.2.2. Оптимум рН протеазы
Зависимость активности протеазы от рН представлена на рисЗ Оптимум активности протеазы находится в сильнощелочной области между рН 11 и 12.
6.2.3. Ингибиторный анализ протеазы
Для определения типа исследуемой протеазы был проведен ингибиторный анализ. Ввиду того, что исследуемый фермент обладает сильнощелочным оптимумом рН, обработку протеазы ингибиторами проводили при двух различных значениях рН: рН 11.0 и рН 7.5. Было обнаружено, что активность протеазы сильно подавляется ингибиторами ферментов серинового типа ВЕР, РМБР и овомукоидом. Менее эффективны были ингибиторы ферментов тиолового типа: РСМВ и ЫЕМ. ЭДТА оказывала слабое влияние на активность протеазы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что протеаза из личинок большой восковой моли относится к типу сериновых ферментов, содержащих реакционно-способный остаток серина в каталитическом центре.
Таблица 2. Влияние ингибиторов на активность протеазы из личинок
большой восковой моли
Ингибиторы
Концентрация М
Остаточная активность, в %
рН 11
рН 7,5
ББР
10~6
103+1
100±7
Ю-5
96±4
99+2
1(Г4
76±4
79±6
10~3
30±2
52+1
РНБР
1(Г6
100±6
98-1
10~5
96-4
86-1
ю-4
90-8
68-3
10"*
81-4
36-2
Овомукоид
10~6
96-4
96-2
ю-5
87-6
86-2
1(Г4
30-3
32-2
10 3
22-2
23-2
РСМВ
ю-6
95-6
99-2
ю-5
57-2
63-2
ю-4
52-3
52-2
1(Г3
40-5
53-2
№М
ю-4
102±7
95±1
ю-3
106+6
92+2
ЭДТА
ю-3
100±3
91±2
ю-2
97±5
91±4
29
6.2.4. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность протеазы
Результаты экспериментов по определению влияния ионов двухвалентных металлов на активность протеазы представлены в таблице 3. Протеолитическая активность значительно подавляется ионами ртути и несколько возрастает под действием ионов кобальта. Кальций и кадмий оказывали слабое ингибирующее действие на активность протеазы. Ионы магния, бария, никеля и цинка практически не влияли на активность протеазы.
Таблица 3. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность протеазы
из личинок большой восковой моли
Металл
Концентрация (М)
Остаточная активность (%)
м§
МО-4
99±2
МО-3
98±5
Са
МО-4
100±7
МО"3
89±6
Со
МО-4
101±7
1-Ю-3
134±6
МО-4
104 ±2
11СГ3
102±3
гп
МО-4
99± 3
но-3
104±3
са
1-Ю-4
93±5
1-Ю-3
86±4
Ва
МО-4
101±2
МО-3
97±8
1-Ю-4
46±1
МО""3
44±2
6.2.5. Стабильность протеазы и устойчивость к действию органических растворителей
Выделенная нами протеаза является стабильным ферментом. Активная протеаза экстрагируется из личинок восковой моли 40% этанолом при комнатной температуре, в условиях, при которых лабильные ферменты денатурируют и инактивируются. При хранении экстракта личинок восковой моли в темноте при 4°С, протеолитическая активность сохраняется в течение нескольких месяцев. Протеаза обладает значительной устойчивостью по отношению к денатурирующему действию органических растворителей (рис. 4). Вместе с тем, фермент не обладает высокой термостабильностью. Тридцати-минутное нагревание при 70°С полностью инактивирует протеазу (рис. 5).
30
+
%
100 •
+
£ §
контроль хлороформ: эфир метанол
2:1
о
+
Рис. 4. Остаточная протеолитическая активность после обработки протеазы из личинок большой восковой моли органическими растворителями
(%)|------------------------------------------------------------------------------------
10 20 30 40 50 60 70 80 90 t°C Температура в град. С
Рис. 5. Температурная стабильность протеазы из личинок большой восковой моли
6.3. Локализация протеазы в организме личинок Gallerнa mellonella
С биологической точки зрения представляет интерес вопрос о локализации и физиологической роли фермента в организме большой восковой моли. По данным Кучера с соавторами (Kucera et al., 1984) сильно щелочной оптимум протеолитической активности (рН 10) имеет место только в жировом теле и кишечнике большой восковой моли. Мы предприняли попытку выделения протеазы из жирового тела и кишечника личинок насекомого. Экстракция 40% этанолом с последующей очисткой показала, что данный фермент
31
экстрагируется только из кишечника личинок. Это говорит о том, что исследуемая протеа- за является пищеварительным ферментом кишечника личинок восковой моли.
6.4. Щелочная сериновая протеаза из личинок Gallerнa mellonella
Для представителей класса насекомых характерно чрезвычайное разнообразие режимов питания и потребляемых пищевых продуктов. Насекомые используют в пищу практически все продукты растительного и животного происхождения. Ферменты, участвующие в процессах пищеварения у насекомых, изучены в значительно меньшей степени, чем пищеварительные ферменты млекопитающих. Большая часть работ, проведенных в этой области, была выполнена с использованием гомогенатов и неочищенных экстрактов органов и тканей, а также физиологических жидкостей насекомых. Из отдельных видов насекомых были выделены чистые ферментные препараты, изучены их кинетические параметры, биохимические и структурные свойства. Общее сходство этих ферментов с классическими пищеварительными ферментами млекопитающих является основой современного понимания физиологии пищеварения у насекомых. Особый интерес представляет изучение пищеварительных ферментов насекомых, характеризующихся экстремальными режимами питания и использующих в пищу продукты, не усваиваемые другими животными (шерсть, кожа, древесина, бумага, воск и др.). Изучение пищеварения у таких насекомых сопряжено со значительными методическими трудностями. Так, например, несмотря на многолет-
4
ние исследования, остается загадкой ферментативный механизм расщепления пчелиного воска личинками большой восковой моли (Applebaum, 1985; Тыщенко, 1986).
Пищеварительные протеазы личинок Lapidoptera чешуекрылых изучены более полно по сравнению с пищеварительными ферментами других отрядов класса насекомых. Почти все исследованные протеазы личинок Lapidoptera представляют собой трипсиноподобные или химотрипсиноподобные ферменты серинового типа, ингибируемые DFP, PMSF и другими сериновыми ингибиторами. Исключением является металлосодержащая протеаза, чувствительная к действию DFP, выделенная из личинок плотяной моли Tineola bisselliella (Ward, 1975а). Протеаза из кишечника личинок большой восковой моли, как и большая часть ранее описанных протеаз личинок чешуекрылых, является ферментом серинового типа, ингибируемым DFP, PMSF и овомукоидом.
Пищеварительная жидкость и содержимое кишечника личинок чешуекрылых характеризуются сильно щелочными значениями рН (как правило, выше рН 9). Оптимум рН про- теолитических ферментов, выделенных из кишечника личинок чешуекрылых, обычно находится в этой же области, или даже превосходит физиологическое значение рН кишечно-
32
го тракта (Applebaum, 1985). В этом отношении протеаза из личинок большой восковой моли сходна с пищеварительными протеазами, выделенными ранее из совок Spodoptera littoralis (Ishaaya et al., 1971), Spodoptera litura (Ahmad et al., 1976; 1980) и (Trichoplusia ni (Pritchett et al, 1981), а также с пищеварительными протеазами из личинок тутового шелкопряда Bombyx morн (Eguchi and Iwamoto, 1976; 1982; Sasaki and Suzuki, 1982).
Молекулярная масса протеазы из личинок большой восковой моли близка к молекулярной массе пищеварительных протеаз бражника Manduca sexta (Miller et al., 1974в), платяной моли Tineola bisselliella (Ward, 1975) и тутового шелкопряда Bombyx morн (Sasaki and Suzuki, 1982).
Исследования пищеварительных протеаз чешуекрылых, выполнялись разными авторами, проводились в разных экспериментальных условиях с использованием различных синтетических и естественных субстратов и ингибиторов протеолиза. Это обстоятельство не позволяет нам проводить прямого сравнения имеющихся литературных данных о влиянии ингибиторов, ионов двухвалентных металлов и температуры на активность протеаз насекомых разных видов. Исключением являются работы Егучи и Ивамото.
Так протеаза из личинок большой восковой моли близка к протеазам личинок тутового шелкопряда, описанным Егучи и Ивамото, по таким параметрам, как оптимум pH и термостабильность. Протеазы обоих видов насекомых слабо ингибируются ЭДТА. Вместе с тем, протеазы личинок степени ингибирования DFP, PMSF и РСМВ. Протеазы этих двух видов насекомых различаются также и по отношению к действию ионов двухвалентных металлов. Например, фермент из личинок Galleria mellonella активируется кобальтом и ингибируется кальцием, тогда как протеазы тутового шелкопряда ингибируются кобальтом и активируются кальцием. Пищеварительные протеазы большой восковой моли и тутового шелкопряда в различной степени ингибируются ионами ртути.
Интересной особенностью протеазы из личинок, большой восковой моли, не описанной ранее для пищеварительных протеаз насекомых, является ее стабильность при длительном хранении в 40% этаноле и устойчивость по отношению к денатурирующему действию органических растворителей. Можно предположить, что повышенная устойчивость данного фермента к действию органических растворителей обусловлена гидрофобностью пищеварительной среды личинок большой восковой моли, содержащей значительные количества пчелиного воска и его эмульгаторов, секретируемых клетками кишечника насекомого (Тыщенко, 1986).
33
6.5. Физико-химическая характеристика биологической активности фракции 7-А-25
6.5.1. Растворимость и элементный состав
Фракция 7-А-25 содержит вещество красновато-коричневого цвета, хорошо растворимое в воде, растворимое в 50% этаноле, нерастворимое в 96% этаноле, диэтиловом эфире и смеси хлороформ:метанол (2:1). Вещество фракции 7-А-25 не осаждается из водных растворов насыщенными концентрациями сульфата аммония.
Элементный состав фракции 7-А-25 характеризуется высоким содержанием азота, присутствием серы и фосфора. Фракция 7-А-25 содержит заметные количества железа и кальция (табл. 4).
Таблица 4. Элементный состав фракции 7-А-25
Элемент
Содержание, (%)
Элемент
Содержание, (%)
Н
4,5±0,5
Р
1,46+0,15
С
40,3±0,5
Ре
0,34±0,05
N
7,9±0,5
Са
0,23±0,02
Б
1,66±0,17
О*
43,6
*остальное.
6.5.2. Химический состав фракции 7-А-25
Фракция 7-А-25 содержит высокомолекулярные соединения, не разделяющиеся тонкослойной хроматографией на силикагеле Н. Окрашивание тонкослойных хромато-грамм реагентами, специфичными для различных фидов органических соединений, не выявило в составе данной фракции свободных аминокислот, Сахаров, липидов и фенолов. После гидролиза вещества фракции 7-А-25 в соляной кислоте, в составе гидролиза были обнаружены свободные аминокислоты, что свидетельствует о присутствии соединений белковой природы. Количественное определение белка методом Лоури показало, что фракция 7-А- 25 содержит около 70% белков, около 10,1% основных и 2% ароматических аминокислот. Из основных аминокислот, обнаружены: лизин, гистидин, аргинин.
Кислые пептиды представлены в основном аспарагиновой (13,9%) и глутаминовой (17,7%) аминокислотами, кроме того, мы обнаружили в активной фракции 7-А-25, не- идентифицированный нами компонент небелковой природы.
Небелковый компонент фракции 7-А-25
Ряд факторов свидетельствует о присутствии в биологически активной фракции 7-А- 25 компонента небелковой природы:
34
- содержание белка во фракции 7-А-25, определенное методом Лоури, составляет около 70%;
- фракция 7-А-25 содержит 1,46% фосфора, который не является элементом, входящим в состав аминокислот;
- данная фракция обладает люминесценцией, нехарактерной для белков, не содержащих хромофорных групп (максимум в спектре возбуждения 350 нм, максимум люминесценции 430-440 нм);
после гидролиза фракции 7-А-25 в соляной кислоте, на тонкослойных хроматограммах гидролизата обнаруживается компонент, окрашиваемый азотнокислым серебром.
Таким образом, выделенная из экстракта личинок большой восковой моли биологически активная фракция 7-А-25, содержит кислые пептиды с молекулярной массой 20006000 дальтон. Кроме того, в составе активной фракции содержится неидентифицирован- ный компонент небелковой природы.
6.6. Биохимическая характеристика биологически активной фракции ЗЬ-Н20
Химический состав активной фракции ЗЬ-Н20 исследовали методом тонкослойной хроматографии с последующим окрашиванием хроматограмм р'еагентами, специфичными для различных видов органических соединений. Было обнаружено, что фракция ЗЬ-Н20 состоит, главным образом, из свободных аминокислот, а также неидентифицированных нами компонентов. В составе данной фракции не обнаружено соединений: белковой, углеводной, липидной и фенольной природы. Аминокислотный анализ выявил в составе фракции ЗЬ-Н20 следующие аминокислоты: глицин, аланин, серин, глутамат, аспартет, валин, гистидин, пролин (в порядке убывания концентрации), кроме того были обнаружены 3 минорных соединения, которые не удалось отождествить с аминокислотами - маркерами.
Для определения молекулярной массы фракцию ЗЬ-Н20 подвергали гель- хроматографии на колонках с сефадексом 0-15 и 0-10. В обеих случаях, сократительная активность обнаруженная во фракции ЗЬ-Н20, иллюирующихся с объемами больше свободного объема колонок.
Данное обстоятельство свидетельствует о том, что молекулярная масса ниже предела исключающегося сефадексом О-10, т.е. менее 700 дальтон.
Нами были проведены эксперименты по определению влияния отдельных свободных аминокислот на гладкие мышцы и сердце, содержащиеся во фракции ЗЬ-Н20. Аминокислоты не давали такой стимуляции сокращения, как вся фракция ЗЬ-Н20. Мы предположили, что фактором вызывающим сокращение может быть экдистерон, который легко извлекается из тканей насекомого видно-спиртовыми смесями. Для проверки этого
35
предположения нами были проведены эксперименты с наиболее биологически активной формой этих гормонов (экдистерон, Р-экдизон). Оказалось, что экдистерон в концентрации Ю-7 м/л стимулирует сократительную активность препаратов сердца на 10-15% относительно исходного контрольного уровня, а также усиливает эффект серотонина на гладких мышцах (миометрии), более чем на 30%. Несмотря на наличие эффекта экдистерона (10-15%), суммарный ответ экстракта восковой моли значительно превосходит на гладких мышцах и сердце сократительную активность экдистерона, поэтому вряд ли может претендовать на активное начало в экстракте личинок Gallerнa mellonella.
6.6.1. Происхождение фактора стимулирующего сокращение гладких мышц
Известно, что многие насекомые обладают способностью накапливать биологически активные соединения, получаемые с пищей. Для выяснения вопроса о происхождении фактора, стимулирующего сократительную активность гладких мышц, мы провели сравнение личинок, выращенных на искусственной и естественной* питательных средах. Оказалось, что экстракт личинок, питавшихся искусственным кормом (вощиной) не способен стимулировать сократительную активность (рис. 6). Это экспериментальное обстоятельство навело нас на мысль об экзогенном происхождении активного фактора и его присутствие в экстракте обусловлено особенностью питания большой восковой моли.
£
tf «
н
о «
3 я л Ч' о>
£ g
о. «
25 50 100 200 300 500
Концентрация тестируемого вещества мкг/мл
100
50
о U
Рис. 6. Дозозависимое изменение силы сокращения гл.мышцы (миометрия при действии продуктов пчелиной семьи:
1. Экстракт из личинок, выращен, на искусственном корме (сократительного ответа нет)
2. Прополис 40% спирт
3. Прополис 96% спирт
4. Экстракт восковой суши, являющийся натуральным кормом для восковой моли
36
6.7. Влияние экстракта восковой моли на гладкие мышцы миометрия и сосуды
Для выявления диапазона действия экстракта и его компонентов на биологические объекты, мы использовали препараты гладких мышц (изолированный рог матки крысы - миометрий, и сосуды аорты). Экстракт восковой моли вызывает на гладких мышцах сокращение подобно агонистам М-холинорецепторов: ацетилхолину, адреналину, серотони- ну - дозозависимо (рис. 7). Если наложить кривую «доза-эффект» (рис. 7) на хромато- грамму (рис. 8), то максимальный сократительный ответ гладких мышц будет соотнесен с активной фракцией ЗЬН-20(зашриховано на хроматограмме), а максимальный эффект сокращения препаратов сердца приводится на активную фракцию 7-А-25.
Рис. 7. Дозозависимое сокращение гладких мышц при действии экстракта из восковой моли и Серотонина: 1 - серотонин; 2- действие экстракта на гладкие мышцы миометрии; 3- действие экстракта на сосуды аорты
Рис. 8. Наложение гель-хроматограммы и кривых доза-эффект гл. мышц при выделении активных фракций
37
Ингибиторно-активаторный анализ экстракта показал, что фракции 1-3 на гладких мышцах вызывают серотониноподобное действие, причем фракция 3 усиливает эффект серотонина при их сочетанном действии. Типиндол, блокатор серотониновых рецепторов Б-типа (синтез, в лаборатории проф. Закусова В.В.) снижает эффект экстракта на 40%. Фракции 5-6 вызывали на миометрии и сосудах эффекты подобно простагландинам или их предшественников и были индиферентны к серотонину и ацетилхолину.
Блокировались метиндолом на 35-40%. Фракция 7 блокировалась атропином более чем на 50%, обнаруживая природу активаторов мускариновых рецепторов, фракция 8 была неактивна к серотонину, ацетилхолину, метиндолу, типиндолу, адерналину, ПГ.
6.8. Влияние экстракта большой восковой моли на сердечно-сосудистую систему 6.8.1. Физические нагрузки
Экстракт восковой моли обладает выраженными адалтогенными свойствами, повышая выносливость животных к физическим нагрузкам. На рис. 9 представлены данные по влиянию экстракта на длительность плавания крыс с грузом. Видно, что адаптогенный эффект проявляется начиная с пятых суток и достигает максимума на 20-25 сутки введения экстракта.
ОТ 5 70 15 20 25
Длительность введения экстракта, сутки
Рис. 9. Влияние экстракта на длительность плавания крыс с грузом
6.8.2. Давление и свертываемость крови
Влияние экстракта на величину артериального давления крови исследовали в опытах на кроликах с длительным введением экстракта (180 суток) в дозе 0,25 мл/кг массы тела/сутки (per os). Экстракт вызывал устойчивое снижение артериального давления на 1219%, проявлявшееся на десятые сутки и сохранявшееся до конца эксперимента. Курсовое
38
введение экстракта в дозе 0,5 мл/кг массы тела/сутки (per os) приводило к выраженному замедлению свертываемости крови к концу второй недели эксперимента. Это, а так же наблюдавшееся в те же сроки накопление гликогена сердечной тканью и снижение кровян- ного давления свидетельствует об оптимизации состояния сердечно-сосудистой системы под действием экстракта.
6.8.3. Кардиозащитное действие
Важным показателем функциональной устойчивости органов и тканей является содержание гликогена-основного энергетического и резервного вещества.
Таблица 5. Влияние курсового введения экстракта восковой моли (1.0 мл/кг массы тела/сутки, per os) на содержание гликогена в тканях крыс [М±т; п=6]
Длительность введения экстракта (сутки)
Содержание гликогена в тканях (мкМ экв. Глюкозы/г ткани)
Миокард
Печень
Скелетная мышца
Контроль
16+4
147+25
9,3+1.4
5
33+12
43+9*
4,7+0,8*
10
94+31*
659+148*
28,6+0,8*
15
138+7*
213+46
23,5+1,6*
20
114+14*
445+109*
3,7+0,4*
25
83+39
114+30
3,1+0,6*
Последействие 5
115+8*
49+5*
3,4+0,3*
*Р<0,05
В таблице 5 представлены данные по изменению содержания гликогена в тканях крысы при курсовом введении экстракта восковой моли. Видно, что экстракт вызывает значительное увеличение гликогена в сердечной мышце (миокарде), которое достигает максимума на 15 сутки эксперимента. На 25 сутки, этот показатель начинает снижаться, сохраняя значительное превышение над контролем. Повышенное содержание гликогена сохранялось и после отмены экстракта. В тканях сердца и аорты наблюдалось увеличение содержания пирувата и снижение содержания лактата, что свидетельствует об усилении аэробных процессов в этих органах. Физиологические исследования, проведенные на препаратах (предсердия и папилярных мышц) сердца крыс показали, что экстракт на 2555% увеличивает силу сокращения (рис. 10). Кроме того, при сочетанном действии экстракта из восковой моли и токсических доз сердечного гликозида строфантина К повышается устойчивость сердечных препаратов. Известно, что применение сердечных гликозидов в клинике, чревато передозировкой ъ ввиду узкого диапазона действия
39
лечебного эффекта (рис. Ц). Это (10"6-10"5 М/л), а если учесть и индивидуальную чувствительность, то и он сужается. Экстракт проявляет кардиозащитное действие, повышает устойчивость к токсическому действию сердечных гликозидов, благодаря, вероятно, своим антиоксидантным свойствам.
Рис. 10. Влияние экстракта восковой моли на сократительную активность предсердия и папилярные мышцы крысы
По оси абцисс - концентрация экстракта восковой моли
По оси ординат - сократительны ответ мышц в % к контролю
' *
В работах Меерсона Ф.З. показано, например, что острый инфаркт представляет собой сильный стрессорный фактор, вызывающий значительное усиление биосинтеза и высвобождение катехоламинов, которые становятся источником активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и торможения антиоксидантой защитной реакции. Это и приводит к нарушению сократительной функции и развитию в нем очагов поражения.
Для проверки этого предположения,наличия антиоксидантной активности и защиты сердца от повреждения при ишемии, мы провели на стареющих крысах (12 мес.) курсовое введение экстракта (0,25 мл/кг массы тела/сутки per os) с последующей тотальной искусственной ишемией в течение 3 недель. Так к концу первой недели введения экстракта животным, длительность переносимой ишемии возрастала в два раза по сравнению с контролем/ а к концу третьей этот эффект сохранялся.
6.8.4. Энергетический обмен и токсичность
Исследование влияния курсового введения экстракта на дыхание митохондрий сердца проводили на старых крысах (12 мес.) для которых характерно состояние хронического стресса, проявляющееся на митохондриальном уровне в виде гиперактивации энергетического метаболизма. Экстракт вводили перорально в дозе 5 мг/кг в течение 3 недель. Курсовое введение экстракта приводило к устойчивому снижению скорости окислительного
40
фосфорелирования на 14-21 сутки эксперимента, приближая ее к уровню, характерному для молодых животных, находящихся в спокойном состоянии рис, 11-12.
В качестве субстрата дыхания использовали сукцинат, окисление сукцината в тканях животных, получавших экстракт, идет по пути полного цикла трикарбоновых кислот, минуя аспартат-аминотрансферазный путь образования сукцината после переамини-рования глутамата со щавелевоуксусной кислотой. Кратковременное введение экстракта в течение 24 часов крысам, вызывало снижение содержания катехоламинов в сердечной мышце, что благоприятно сказывалось на состоянии сердца.
Рис.11. Кардиопротекторное действие экстракта воск, моли на сердце при интоксикации строфантином К (сердечный гликозид)
1 - строфантин К-доза-эффект
2 строфантин К + экстракт восковой моли -доза-эффект
Токсические эксперименты, проведенные на крысах, показали, что острая токсичность экстракта восковой моли очень низка по сравнению с его терапевтическими дозами (1ЛЭ50=9,6). Таким образом, экстракт восковой моли оказывает разностороннее биостиму- лирующее действие на организм млекопитающих животных, включая адаптогенные, кар- диозащитные, гипотензивные и гипокоагулянтные свойства.
6.9. Растительные источники': что получают пчелы от медоносных растений
В последнее время отмечается растущий интерес и спрос на продукты пчеловодства для использования их в медицине и в диетическом питании.
Часть применяемых пчелами веществ является их выделениями, другие же вещества получены ими от растений, в результате сборной деятельности. Все эти вещества названы человеком - продуктами улья: пчелиный воск, пчелиный яд й личиночный корм являются выделениями пчел (т.е. продуктами деятельности спец. желез рабочих пчел).
Рис. 12. Влияние курсового введения экстракта восковой моли (5 мг/кг массы тела сутки рег ов) на параметры дыхания митохондрий сердца старых крыс
Контроль - толстая линия
Опыт - тонкая линия
Субстраты дыхания 1.0 мМ сукцинат, добавка АДФ - 200 мкМ
А - МХ сердца, 14 сутки
Б - МХ сердца 21 сутки
1 - контроль, 2- экстракт восковой моли, 3 - экстракт восковой моли, дыхание в присут- стви 1 мМ аминоокисацетата
Собранные пчелами вещества - это пыльца и прополис, которые складированы непосредственно в улья пчелами без особой трансформации, нектар и падь складируются пчелами в улья только после превращения их в мед.
Нектар и пыльца являются производными цветковых растений.
Нектар - сахаристый сок выделяемый особыми железами растений обычно расположенными в цветке, реже на листьях растений и привлекает опылителей и насекомых и птиц - нектарки (отр. Воробьиных, обитающих в Южной Азии, Африке, Австралии).
Пыльца (перга) или по определению пчеловодов - пчелиный хлеб. Роль цветочной пыльцы в жизнедеятельности пчел трудно переоценить! Прежде всего это незаменимый истоник белкового корма. Каждая цветочная пылинка - это сложный концентрат многих весьма ценных пищевых илечебно-профилактических веществ, содержащих пептоны, глобулины, аминокислоты, углеводы, жирообразные вещества, ферменты, минеральные вещества, витамины (В'ь Вг, Вб, Вп, А, Б, Е, К), микро и макроэлементы : Б, А1, Мп, Мо, Си, Са, Ре, Ыа, К, N1, ванадий, хром, цирконий, берилий, бор, Zn, цинк, олово, свинец, стронций, таллий, Ва, 1л.
РОСС"1 " ГОСУДдРС1' 41 БИБЛИОТЕКА
При тщательном изучении химических свойств цветочной пыльцы было установлено, что пылинки различных растений отличаются содержанием белков, жиров, углеводов, витаминов и минеральных солей. Кроме того было обнаружено, что пыльца растений может служить прекрасным источником для получения каротина. Например, содержание каро-
42
тина в пыльце лилии и ж.акации в 20 раз превосходит содержание его в красной моркови, считающейся основным источником промышленного получения этого вещества. Кроме того цветочная пыльца богата рутином (витамин Р). В пыльце некоторых растений, в частности гречихи посевной, содержание рутина достигает (7-и %). Таким образом;наличие в цветочной пыльце ценных и необходимейших для человеческого организма витаминов, ставит ее в ряд важных средств, обладающих многосторонними лечебно-профилактическими свойствами.
Научной медициной в настоящее время еще не достаточно применяют цветочную пыльцу с лечебной целью, хотя в арсенале народной медицины перга хорошо известна как средство, обладающее многосторонними лечебно-профилактическими свойствами.
Еще со времен Аристотеля, ученых интересовал вопрос, почему матка, вышедшая из такого же яйца, как и все пчелы, почти в два раза длиннее и тяжелее пчел-тружениц, почему она обладает удивительной способностью откладывать огромное количество яиц (до 2 тыс. и более в сутки) почему она живет около 6 лет, а ее дочери пчелы-труженицы всего 30-35 дн. Разгадать эту тайну природы помогли научные исследования.
Яйцо, из которого выводится матка пчелы, помещают в специальную восковую ячейку желудеобразной формы - так называемый маточник.
При появлении личинки пчелы кормят ее особой пищей - маточным молочком. Многие западные специалисты называют маточное молочко - «королевским желе».
Маточное молочко - это секрет двух аллотрофических желез - глоточной и верхнечелюстной - это пастообразная, непрозрачная масса молочно-белого или слабо-кремового цвета, слегка жгуче-кислого вкуса. При комнатной температуре оно высыхает, приобретая желтоватый оттенок.
В маточном молочке не обнаружены микроорганизмы, так как оно обладает способностью к самостерилизации. В свежем маточном молочке содержится около 14% белков, -5% жиров 9-18% углеводов, -1% минеральных и др. веществ. В сухом же веществе 3558% белков, 6-19% жиров и до 28% углеводов. Основными компонентами белков являются простые белки: альбумины и глобулины (содержащиеся в равном количестве), а также сложные белки: нуклеопротеиды, гликопротеиды и кинопротеиды. В составе белков обнаружено 21 аминокислота, в том числе 10 незаменимых.
Белки маточного молочка обладают ферментативной активностью и принимают активное участие в обмене веществ.
Маточное молочко богато также пантотеновой и никотиновой кислотами, веществами групп витаминов В, обнаружены биоптерин и нептерин. Установлено содержание нуклеи-
43
I
новых кислот. Большое значение имеет содержание в маточном молочке многих витаминов: тиамина (1,2-18,0 мкг на 1 г свежего вещества), рибофлавина (6,0-28,0 мкг), пиродок- сина 2,2-50 мкг), никотиновой, пантотеновой и фолиевой кислот, роль которых в организме многогранна.
Включаясь в состав ферментных систем они поддерживают на необходимом уровне б/х р-и и тем самым создают наиболее благоприятные условия для взаимодействия организма с окружающей средой. Им принадлежит большая роль в профилактике не только авитоминозных, но и других заболеваний.
В маточном молочке содержатся АХ (467-5000 мкг на 1 г/в-ва) - являющимся медиатором нервного возбуждения в ц.н.с., М - холинорецепторных холиноорганических и двигательных нервов, холинэстераза, кислая фосфатаза и ряда других ферментов: амилаза, каталаза, инвертаза, протеаза.
Маточное молочко содержит витамин Е, способного стимулировать половую деятельность, а также микроэлементы Ре, Мп, кобальт, хром, Аи, ртуть, мышьяк, висмут и др.
В процессе хранения содержание БАВ в маточном молочке снижается в результате разрушения компонентов под действием света, температуры, кислорода и др. факторов. Сухое (лиофилизированное) маточное молочко может хранится при 1=0-14° и относительной влажности 75% около 5 лет.
Мед. Известно много сортов меда, различающихся по ряду признаков: флористический, региональный, технологический. По флористическим признакам т.е. в зависимости от источника, из которого пчелы взяли нектар. Мед может быть цветочным и падевым, среди цветочных медов различают монофлерный, приготовленный из нектара преимущественно одного вида растений, и полифлерный - из нектара различных медоносов. Разумеется абсолютно монофлерные сорта меда встречаются редко. Полифлерные сорта меда получают название от пчелиных пастбищ (угодий). Это луговой, степной, горный, таежный, фруктовый (сады) и т.д.
По региональному признаку различают сорта меда, собранные в различных областях: дальневосточный липовый, башкирский липовый и т.д.
По технологическому признаку т.е. по способу получения и обработки, различают сотовый и центробежный (спусковой) мед. Сотовый мед залит пчелами в шестигранные ячейки, запечатанные восковыми крышечками. Этот мед поступает потребителю не только в естественной таре, но и в идеальном чистом виде в совершенно зрелом состоянии. Бактериологические исследования показали, что сотовый мед стерилен. Центробежный
44
мед получают при откачке его из сотов на медогонке и отпускается потребителю в расфасовке - банках и т.д.
Качество меда определяется по цвету, вкусу и аромату. Выше ценятся светлые сорта меда (акациевый, липовый и др.) исключением является гречишный. В тоже время темные сорта более богаты минеральными веществами, представляющими ценность для организма.
Мед почти целиком состоит из Сахаров - глюкозы и левулезы, кроме того по содержанию ферментов мед занимает одно из первых мест среди продуктов питания: диастераза, инвертаза, каталаза, кислая фосфатаза и др.
В составе меда находятся соли: Са, К, М§, Бе, С1, Р, Б, I, микроэлементы Мп, 81, А1, В, хрома, Си, 1л, N1, РЬ, олова, титана, осмия.
В меде содержатся ряд органических кислот (яблочная, винная, лимонная, молочная, щавелевая), а также белки, витамины, дериват хлорофилла - ксантофилл, биогенные стимуляторы и ростовые вещества (биосы).
Содержание витаминов в меде зависит от примеси в нем цветочной пыльцы. Удаление цветочной пыльцы из меда при фильтровании лишает мед витаминов.
Кроме того, известны и ядовитые меды, так, например: на Дальнем Востоке пчелы делают ядовитый мед, собирая нектар с ядовитых цветов болотного кустарника вереска и багульника. Интересно, что мед полученный с ядовитого багульника опасен только для человека и не опасен для пчел.
К.Ш.Шарашидзе разработал способ обезвреживания «пьяного» меда - подогревая его при температуре 46° и давлении 65 мм, при этом ядовитые свойства улетучиваются, а лечебные свойства сохраняются. При длительном хранении токсин «пьяного» меда даже в обычных условиях значительно снижается.
Особое место среди описанных медов занимает падевый мед, пчелы делают его не из нектара цветов, а главным образом из выделений насекомых: тлей, червецов, листоблошек и др., соков деревьев, листьев. Эти насекомые питаются соками растений, а жидкие сладкие капли их выделений падают вниз с листьев деревьев, поэтому они и получили название пади. Нектар цветов состоит почти исключительно из сахара, а в пади содержится около 70% азотистых веществ и декстрина. Падевый мед обычно темный, тягуч, часто неприятного вкуса, со слабым ароматом. Опыты показали, что падевый мед по сравнению с цветочным имеет более слабые бактерицидные свойства. Падевый мед богаче цветочного минеральными веществами (солями).
45
Прополис - это клейкое смолистое вещество растительного происхождения, собирается пчелами с почек тополя, осины, каштана, дуба, ивы, хвойных, но главный источник - это береза и тополь. Прополис представляет собой сложную механическую смесь определенных групп веществ: смолы 50-85%, эфирные масла 4,5-15%, воска 12-40%, дубильные вещества 4-10,5%, мех. примеси 5-15%, пыльцы 5-11%, а также органические кислоты, флавоноиды, спирты, макро и микроэлементы. В состав прополиса входит коричный спирт, придающий продукту клейкость и характерный запах, установлено наличие кофейной, бензойной и коричной кислоты. Флавоноидный комплекс характеризуется присутствием акацетина, кемпферола, рамноцитрина, изорамнетина, рамназина, проявляющих Р-витамин. Антимикробное и ранозаживляющее действие.
В составе прополиса не обнаружено белков, нуклеиновых кислот, липидов и гормонов. Одним из замечательных свойств прополиса является устойчивость его действующих веществ по отношению к высокой температуре, ультрафиолетовым лучам.В этом отношении прополис более стабилен, чем другие продукты улья: мед, пыльца, маточное молочко, воск.
Пчелиный воск - первоначально находится в жидком состоянии, но соприкосаясь с воздухом - твердеет. Воск вырабатывается в результате метаболизации поглощенных питательных веществ.
Цвет воска зависит от примесей (прополисной смолы) и может меняться от белого до коричневого.
В состав воска входят эфиры, свободные жирные кислоты, спирты, углеводороды, пигменты и другие вещества. Кроме того в воске обнаружено значительное количество витамина А.
Воск нашел применение в косметической промышленности, медицине и др. отраслях народного хозяйства.
6.9.1. Влияние продуктов пчелиной семьи на гладкие мышцы
Чтобы выяснить какой вклад вносят продукты пчеловодства в экстракт из восковой моли, нами проведен скрининг продуктов жиднедеятельности пчел: прополиса, перги, неочищенного пчелиного воска (темная восковая сушь), цветочной пыльцы-обножки, маточного молочка (апилак). Большая часть этих продуктов является питательным сырьем для большой восковой моли. На рис. 13 показано, что все исследованные продукты пчелиной семьи обладают положительным миотропным действием, т.е. вызывают сокращение изолированного рога матки крысы - дозазависимо.
46
I |/г ® 3
I-____ 1____ 1 1 1 [ I I
О го 40 60 80 О 200 400
хсацентрацкя тестируемого вещества, мхг/кх
к<яцентрацкя тестируемого веществе, икг/их
Рис. 13. Миотропное действие продуктов пчелиной семьи на миометрий крысы
1 - этанольный (96%) экстракт перги; 2 - водный экстракт прополиса; 3- этанольный (40%) экстракт прополиса; 4 - этанольный (96%) экстракт прополиса; 5 - этанольный (96%) экстракт цв. Пыльцы; 6 - этанольный (40%) экстракт восковой суши; 7 - маточное молочко; 8 - мед
Наибольшую миотропиую активность проявлял этанольный (96%) экстракт перги, а так же водный и этанольный (96%) экстракт прополиса (максимальные ответы при разведении сухого вещества 1:100 и 1:50, соответственно). Этанольный 96% экстракт цветочной пыльцы и этанольный (40%) экстракт восковой суши в разведении 1:50, мед и маточное молочко (апилок) максимальный ответ сокращения при разведении (1:80 и 1:50, соответственно). Водорастворимые фракции перги и цветочной пыльцы, а так же экстракт личинок восковой моли, выращенных на искусственной питательной среде не вызывали сокращения гладких мышц миометрия и сосудов.
47
Миотропное действие меда и маточного молочка (апилак) обусловлено содержанием в этих продуктах ацетилхолина (Abdel-Wanab Sm. Et al., 1979; Valente D., 1981). Имеющиеся в литературе данные по составу перги, цветочной пыльцы и прополиса не позволяют нам высказать определенных предположений о химической природе фактора, определяющего их миотропную активность (Margues L.A., Mendes E.G., 1981). Нерастворимость активных факторов перги и цветочной пыльцы в воде, по-видимому, свидетельствует о том, что миотропное действие этих продуктов обусловлено не ацетилхолином, а иными химическими соединениями.
Следует отметить, что во всех пробах содержащих спирт, мы исследовали влияние спирта на биологические препараты. На рис. Н приведена зависимость «доза-эффект» для спирта, из которой видно, что концентрация спирта от 0,5 до 0,9% стимуляцию на гладкие мышцы не оказывает, от 1,5% и до 3% спирт оказывает стимулирующее влияние на мио- метрии и расслабляющее действие на сосуды, причем это действие прямо- пропорционально концентрации. В наших экспериментах концентрация спирта не превышала 0,8-0,9% на мышечную ткань, и искажение эффекта не наблюдали.
0,5 i
концентрация спирта в % Рис. 14. Кривая доза-эффект для спирта на гладких мышцах миометрии
6.9.2. Скрининговый анализ продуктов жизнедеятельности пчел
На рис. 15' представлены данные скринингового анализа продуктов пчелиной семьи. Мед при разведении (1:1600) проявляет свойства блокатора м-холинорецепторов, подобно атропину, при разведении (1:80) наоборот усиливает действие активатора этих рецепторов - ацетилхолина. Мы провели определение количественного содержания ацетилхолина и серотонина в некоторых продуктах пчел табл. 6.
123 425 6 2 7
Рис. 15. Влияние на сократительную активность миоме грия меда, АХ, атропина и их сочетанием действии:
1. Атропин (10"6) М; 2. АХ 10'7; 3. Атропин +АХ; 4. мед (разведение 1:1600); 5. Мед П600+АХ107; 6. Мед (1:80); 7. АХ + Мед (1:80)
Таблица 6. Содержание ацетилхолина и серотонина в продуктах пчеловодства
Продукты пчел
Содержание сухого вещества в продукты, мкг/г
Ацетилхолин
Серотонин
Мед
1,2
0,2
Прополис
2,4-3
0,025
Перга
0,1-0,4
0,01-0,02
Цветочная пыльца
0,04
-
В прополисе обнаружено содержание простагландинов (ПГ), причем в спиртовом (96%) экстракте их больше, чем в водном.
6.9.3. Цитотоксичность продуктов пчелиной семьи
48
150 "
На рис. 16 представлены результаты исследования цитотоксичносги продуктов пчел, из которого видно, что мед, маточное молочко и цветочная пыльца оказались не токсичны для клеток Raji , а экстракт перги и восковой суши оказали умеренное ингибирующее действие на рост клеток. Наиболее выраженным цитотоксическим действием обладал прополис. Водный экстракт, в основном) содержит ароматические кислоты и сахара. Поэтому он в меньшей степени подавлял рост клеток, чем этанольные экстракты, содержащие флавоноиды. Этанольный (96%) экстракт прополиса проявлял меньшую токсичность, чем этанольный (40%) экс-
49
тракт, вероятно, вследствии слабой растворимости агликонов, флавоноидов прополиса в воде. Предполагается, что токсичность прополиса для клеток млекопитающих, как и его антимикробное действие, обусловлено фенольными соединениями.
0.5 5 50 500 0.5 5 50 500
Рис. 16. Влияние продуктов пчелиной сесьи на рост культуры лимфобластоидных клеток человека линии
По оси абсцисс: концентрация тестируемого вещества в среде культивирования мкг/мл По оси ординат: конечная плотность клеток, по сравнению с контролем, в % 1 - этанольный (96%) экстракт цв.пыльцы; 2- водный экстракт цв.пыльцы; 3- маточное молочко; 4- мед; 5 - этанольный (40%) экстракт восковой суши; 6- этанольный (96%) экстракт перги; 7- водный экстракт перги; 8 водный экстракт прополиса; 9 - этанольный (96%) экстракт прополиса; 10 - этанольный (40%) экстракт прополиса
6.9.4. Витаминно-лекарственные меды
Известно, что очень малые дозы витаминов не только предохраняют организм человека от различных заболеваний (авитаминозы), но и способствуют повышению его защитных сил. Экспериментально доказано, что концентраты витамина С из плодов шиповника и других растений имеют более эффективные лечебные свойства, чем синтетическая аскорбиновая кислота. Это объясняется тем, что в концентрате аскорбиновой кислоты, полученной из растительного сырья, присутствуют и другие биологически активные вещества, например: флавоны, катехины и близкие к ним соединения. Клиническими наблюдениями установлено, что синтетические витамины усваиваются лучше, если человек получает их в сочетании с естественными продуктами питания. В этом отношении поливита- минизированный мед - незаменимый продукт. Его получают двумя способами: экспрессным методом и механическим смешиванием витаминов и меда. Обогащение меда витаминами облегчается, благодаря высокой гидроскопичности меда (20% воды). Водорастворимые витамины С, Вь В2, РР быстро растворяются и распределяются между кристаллами
50
глюкозы, жирорастворимые витамины А, Д дробятся на мельчайшие шарики, и тоже распределяются между кристаллами глюкозы и левулезы. Вязкость меда препятствует слиянию мельчайших жировых витаминных шариков, через шесть месяцев в меде сохраняется примерно 50 % естественной аскорбиновой кислоты и 60-90% искусственно введенной. Это дает основание предполагать, что пчелиный мед содержит особые стабилизирующие вещества.
Препараты меда в сочетании с комплексом витаминов - это замечательные биологические стимуляторы.
Экспрессный метод получения меда состоит в том, что пчелам предлагается на переработку сладкий сахарный сироп, в который добавлены лекарства, витамины, биологически активные вещества.
Пчелы-фармацевты аккуратно перерабатывают предложенный витаминный корм, который после пребывания в желудке пчелы обогащается ферментами, биохимическими элементами меда, органическими кислотами и др. веществами. В данном случае мед представляет собой не только приятную оболочку для лекарственного содержимого, но и важное лечебное средство.
Мы не удержались от возможности посмотреть на сердечных препаратах некоторые манипуляции с медом, не имея возможности использовать витаминный мед, приготовленный самими пчелами. Для начала мы провели эксперимент на сократительную активность спонтанно сокращающегося предсердия крысы. Сняли зависимость «доза-эффект» чистого меда, затем тоже самое проделали с хлористым кальцием, который также дозозависимо увеличивал силу сокращения, но характер этой кривой был другим. СаСЬ в высоких концентрациях 100 мг/кг вызывает индуцированные аритмии сердечного ритма. При сочетанием действии меда и СаСЬ - снижалось нарушение сердечного ритма, если в этом случае наслаивать другие воздействия, например токсические дозы сердечных гликозидов, то у сердца появляется как бы резерв «второе дыхание» и оно не останавливается, как при интоксикации строфантином К.
Таким образом, витаминные меды, то есть полученные экспрессным методом, а также витаминизированные, то есть, полученные искусственным обогащением натурального пчелиного меда витаминами и другими лекарственными компонентами, должны занять достойное место в профилактике заболеваний и преждевременного старения.
51
6.9.5. Практическое исследование препарата из экстракта большой восковой моли Gallerнa mellonella на автоматизированном компьютерном комплексе экспресс- диагностики
В настоящее время, имея на руках готовое средство (лекарственный препарат из большой восковой моли Gallerнa mellonella) мы исследовали на добровольцах-испытуемых однократное и курсовое применение препарата в концентрации 2-3 капли на 10 кг веса (в качестве профилактики) и 4-5 капель на 10 кг веса (лечебная доза) - один раз в день. Обследование проводилось до принятия препарата 5 во время а и через курс лечения, длившейся 15 дней, методом полиметрической экспресс-диагностики.
На рис. 17 представлен общий вид автоматизированной системы экспресс- диагностики, состоящей из кресла с монтированными датчиками для снятия физиологических данных (ЭКГ, РВГ, ЭМГ, датчики давления, дыхания, пульса, температуры), регистрирующей и обрабатывающих систем.
54'
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследованиями в данной работе было установлено, что этанольный экстракт из личинок (Gallerнa mellonella) обладает выраженным кардиозащитным и антикоагулянтным действием, вызывает усиление аэробных процессов в сосудистой стенке аорты. Такое действие сохраняется в течение нескольких месяцев.
С медицинской точки зрения возможно применение экстракта в терапевтической практике, тем более, что его достоинством является отсутствие в нем токсических и повреждающих клетки веществ. В настоящее время, традиционно, стали использовать в терапевтических целях ферментные препараты, в том числе и препараты протеаз для лечения некоторых сосудистых заболеваний (Вольф Ранзберг, 1976, Hollenberg, 1982). Поэтому можно видеть, что БАВ, содержащиеся в экстракте из личинок (Gallerнa mellonella), кроме описанных в данной работе эффектов, вызывают усиление регенерации нейронов и рост клеток (Спиридонов Н., Архипов В., 1979) и сериновая протеаза участвует в реализации этих терапевтических эффектов. Другим вероятным кандидатом на роль терапевтического действия экстракта является экдистерон и родственные ему стероидные гормоны большой восковой бабочки (Hsia et al, 1979, Peantevin, 1984), обладающие мембраностабилизируюшим, адаптогенным и анаболическим действиями в организме млекопитающих (Uchigana and Otakal974; Громова и др., 1977; Сыров, Курницкий, 1977; Айзиков 1976).
Содержание в гемолимфе личинок (Gallerнa mellonella) у-аминомаслянный кислоты (Lungeis, 1980), а также продуктов ее окисления, обладающих гипотензивным тормозным и антистрессорным действиями в организме млекопитающих животных и человека, также вносят свой вклад в терапевтический эффект. В последние годы этанольный экстракт прополиса находит применение в геникологии при лечении воспалительных процессов и послеоперационных осложнений. Основанием для этого являются антимикробные и эпитализирующие свойства экстракта. Очевидно, что при назначении такого лечения следует принимать во внимание стимулирующие влияние экстракта прополиса на сократительную функцию матки. По нашим исследованиям, учитывая миотропное действие экстракта из личинок (Gaьeria mellonella), применение этого препарата нежелательно в период беременности. Таким образом, результаты данных исследований подтверждают показания народных целителей и согласуются с клиническими данными о перспективности применения экстракта из личинок (Gallerнa mellonella) в медицине для терапии, сердечно-сосудистых заболеваний, а также профилактики и повышения адаптационных возможностей организма в условиях стресса.
55
Практические рекомендации.
Результаты работы могут представлять интерес для специалистов в областях экологии биоресурсов, физиологов и биохимии насекомых, производстве биологически активных веществ и медицины, а также специалистов в области фармакосанации - разделе фармакологии о действии БАВ, поступающих в организм с пищей или в виде лекарственных препаратов:
а) Экстракт из личинок Gallerнa mellonella является комплексом биологически активных веществ типа пищевой добавки и может быть успешно использован в практике восстановительной медицине при повышенных физических и эмоциональных нагрузках.
б) БАВ экстракта из личинок Gallerнa mellonella оказывает на организм биостимулирующее действие, сочетая в себе кардипротекторные, адаптогенные и гипотензивные свойства, поэтому может быть рекомендовано в физиологической практике, особенно для людей чувствительных к перепадам атмосферного давления.
в) Полипараметрический метод на автоматизированном компьютерном комплексе экспресс-диагностики позволяет в течение 2-3 минут оценить функциональное состояние пациентов, а графический метод представления результатов позволяет оценивать в наглядной форме исходное состояние пациента и делает для врача доступным контроль и интерпретацию результатов и позволяет делать выбор адекватных методов профилактики и лечения.
г) Технология получения экстракта в лабораторных условиях не представляется сложным процессом и может быть рекомендована производству для получения массового конечного продукта в виде: сублимированных форм (таблетки, капсулы, пилюли) или жидких форм Б АД - в виде бальзамов и капель.
ВЫВОДЫ
1. Исследовано действие экстракта из личинок (Gallerнa mellonella Z.) на сердечнососудистую систему и гладкие мышцы миометрия. В составе экстракта обнаружены биологически активные вещества:
а) фактор, стимулирующий сократительную активность сердечно-сосудистой системы и гладких мышц миометрия, - содержит кислые пептиды, имеет экзогенное происхождение и содержится в естественном корме личинок (Gallerнa mellonella) - темная восковая сушь;
б) установлено, что сериновая протеаза, участвующая в рассасывании и растворении бляшек и тромбов в сосудах, миокардиальных клетках и легочной ткани, - локализована в кишечнике личинок и является их пищеварительным ферментом. Определена молекулярная масса сериновой протеазы (26 тыс.дальтон) , с оптимумом активности в сильнощелочной области между рН= 11-12.
2. Экстракт из личинок (Gallerнa mellonella) обладает выраженными адаптогенными свойствами, повышая выносливость животных к физическим нагрузкам, не содержит токсических компонентов, о чем свидетельствует LD 50 = 9,6.
3. В продуктах жизнедеятельности пчел (мед, перга, прополис цветочная пыльца) частично входящих в экстракт личинок определено количественное содержание ацетилхолина и серотонина. Установлено, что цитотоксическое действие прополиса проявляется в более низких концентрациях (50 мкг/мг), чем его антимикробное (500мкг/мг) действие.
4. Экстракт из личинок (Gallerнa mellonella) оказывает на сердечно-сосудистую систему и гладкие мышцы экспериментальных животных кардиопротекторные свойства, устраняя отрицательный эффект при передозировке сердечными гликозидами. Установлено, что экстракт из личинок (Gallerнa mellonella) стимулирует сократительную активность сердца (папилярные мышцы) на 55%, предсердия на 20%, гладкие мышцы (миометрия) на 80%, что свидетельствует о высокой эффективности экстракта.
5. Экстракт из личинок (Gallerнa mellonella) вызывает снижение артериального давления на кроликах, подвергавшихся гиподинамическим и стрессорным факторам, в среднем на 17%.
6. В процессе анализа динамики функционального состояния человека полипараметрическим методом отмечено позитивное влияние экстракта из личинок (Gallerнa mellonella) на функциональное состояние испытуемых, находящихся под действием гиподинамических и стрессорных факторов. Установлено, что:
57
а) в исходном состоянии у здоровых людей, в покое, соотношение пневмоцикла, кардиоцикла и вазоцикла характеризуется гармонической пропорцией с инвариантным коэффициентом;
б) при развитии функционального напряжения возникают различные виды синхронизации автоколебаний по принципу резонанса; в) при перенапряжении и истощении адаптационных процессов (стресс-факторы) возникает десинхронизация автоколебаний с различной степенью отклонения от инвариантного коэффициента Прием БАД в виде экстракта их личинок (Gallerнa mellonella) снижает негативные явления десинхронизации колебательных процессов в сердечно-сосудистой системе.
58
ЛИТЕРАТУРА
1. Апитерапия сегодня. Междунар. Ин-т пчеловодства. Бухарест, Апимоидия, 1982, 88 с.
2. Айзиков М.И., Курмуков Г.Г., Сыров В.Н. Физиологическая активность и коррелятивные изменения в белковом, углеводном и жировом обмене под влиянием экдизонов и неробола. - В кн. Фармакология природных веществ. Ред. Садрутди- нов Б.С. Ташкент, ФАН, 1978, с. 107-125.
3. Ашрафоеа P.A., Сырое В.Н. Общее действие. Токсичность и изменения микроструктуры внутренних органов и тканей экферимена животных при длительном введении экдистерона. - В кн. Фармакология природных соединений. Ред. Садрит- диновБ.С. Ташкент, ФАН, 1979, с. 147-153.
4. Блатнер Р., Классен X, Денерт X., Дёринг X. Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц. М: Мир, 1983.
5. Гримова Т.А., Прусаченко В.К., Яцюк П.К. К характеристике кардиомембра- нотропного действия экдистерона. - В кн. Фармакологическая корреляция кровоснабжения, метаболизма и жизнеспособности ишемизированного миокарда. Ред. Гацура В.В., Тихонов В.П. Воронеж, 1977, с. 66-88.
6. Коваленко Е.А., Березовский В.А., Энштейн И.М. Полярографическое определение кислорода в организме. М: Медицина, 1975.
7. Кузнецова Ю.И. Цели и методы разведения вощиной моли (Galleria mellonella L.). - В кн. Массовое разведение насекомых. Кишенев, 1981. С. 26-30.
8. Иойриш H.H. Пчелы - крылатые фармацевты. М., Наука, 1966, с. 101-105.
9. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессовых и ишемических повреждений сердца. М., Медицина, 1984, с. 125-130.
59
10. Меерсон Ф.З., Казан В.Е., Козлов Ю.П., Белкина JI.M., Архипенко Ю.В. Роль перекисного окисления липидов в патогенезе ишемического повреждения и анти- оксидантной защиты сердца. Кардиология, 1982, № 2, с. 81-93.
11. Меерсон Ф.З. Адаптация к стрессовым ситуациям и стресс-лимитирующие системы организма. - В кн. Физиология адаптационных процессов. М., Наука, 1986, с. 521-631.
12. Миронова В.Н., Холодова Ю.Д., Скачкова Т.Ф., Бондарь О.П., Даценко З.М., Говсеева H.H. Гипостеринемическое действие фитоэкдизонов при экспериментальной гиперхолестеринемии у крыс. Вопр. мед. химии, 1982, т. 28, № 3, с. 101-110.
13 .Погорелое А.Г., Алахвердов Б.Л. Метод расчета объемной концентрации элементов в тонких средах ткани по данным рентгеноспектрального микроанализа. Цитология, 1982, т. 24, № 7, с. 823-825.
14. Поправко С.А. Прополис. Химический состав, биологическая активность. - В кн. Труды междунар. симпозиума по применению продуктов пчеловодства в медицине и ветеринарии. Бухарест, Апимоидия, 1972, с. 133-137.
15. Поправко С.А., Тихомирова В.И., Вулъфсон Н.С. Сравнительное изучение химического состава и биологической активности прополиса и его источников. - В кн. Ценный продукт пчеловодства: прополис. Ред. Харнопс 4-е изд. Бухарест, Апи- мовдия, 1981, с. 35-37.
16. Поправко С.А., Соколов Н.В., Торгов И.В. Производные ненасыщенных ароматических спиртов в прополисе и смоле росного ладана. Химия природ, соед., 1984, №2, с. 152-160.
17. Росс Г., Росс Ч, Росс Д. Эпимоидия. М., Мир, 1988, 572 с.
18. Сырое В.Н. К механизму анаболического действия фитоэкдистероидов в организме млекопитающих. Биолог, науки, 1984, т. 251, № 11, С. 16-20.
60
19. Сыров В.Н., Курмуков А.Г. Об анаболических и андрогенных свойствах эк- дистерона, циастерона и метиландростендиола. - В кн. Вопросы фармакологии и токсикологии. Ред. Закирова У.Б. Ташкент, 1975, с. 92-94.
20. Сыров В.Н., Курмуков А.Г. Об Об анаболической активности фитоэкдизона - экдистерона. Фармаколог, и токсикол., 1976, т. 39, № 6, с. 690-693.
21. Глинник А.Н., Гопанович В.Я. Антибактериальные свойства прополиса. Журн. ушн. нос. горл. Болезни, 1981, № 4, с. 75-76.
22. Маликов М.М., Есенбаева В.З., Асанова Д.Т. Влияние экдистерона на показатели углеводного обмена печени и миокарда в возрастном аспекте. Мед. журн.. Узбекистана, 1982, № 11, с. 68-69.
23. Ташмухамедова М.А., Алшатов К. Т., Сыров В.Н. и др. Влияние фитоэкди- стероидов и стерооноболов на дыхание и окислительное фосфорелирование митохондрий печени крыс при аллоксановом диабате. Биол. науки, 1988, т. 261, № 9, с. 37-39. л
24. Тыщенко В.П. Физиология насекомых. М., Высшая школа, 1986, с. 303.
25. Шамрай Е.Ф., Федуров В.В. Витамин Д. Химическая природа и механизм физиологического действия. Успехи совр. биолог., 1968, т. 65, № 2, с. 186-201.
26. Харборн Д.Ж. Введение в экологическую биохимию. М., Мир, 1985, с. 312.
27. Холодова И. Д. Фитоэкдизоны - биологически активные полигидроксилиро- ванные стерины. Укр. биохим. журн., 1979, т. 51, № 5, с. 560-575.
28. Ahmad Z., Sallemuddin М., Siddigt М. Alkaline protease in the larvae of thearmy worm, spodoptera litura - Insect Biochem., 1976, v. 6, p. 501-505.
29. Ahmad Z. et al. Purification and characterization of three alkaline proteases from the gut of the larva of army worm, spodoptera linura - insect Biochem., 1980, v. 10, p. 667-673.
61
30. Addel-Wahab S.M., Selim M.A. Shenata M.M. Detection and estimation of neurohor-monal substance in Noney and royat jilly. Egypt. J. Pharm. Sei., 1979 (publ. 1982), v. 20, p. 353-363.
31. Ban J., Popovic S., May singer D. Cytostatis effects of propolis in vitro. - Acta Pharm. Jugoslav., 1983, v. 33, p. 245-255. Chem. Abs. 100: 61486t.
32. Bennet R.D., Ko S.T., Heftmann E. Isolation of estrone and cholesterol from the date palm Phoenix dactylifera L. - Phytichem., 1966, v. 5, p. 231-235.
33. Bergner K.G., Sahir D.M. Proteins of honey. IV. Fractionation and characterization of honey amylase by electrophoresis and isoelectrric focusing. - Z.Lebensm. - Unters.Forsch., 1979, Dl. 169, s. 159-164. Chem.abs. 91: 188494 v.
34. Bogdanov S. Characterization of antibacterial substrances in honey. - Lebensm.- Wiss.Technol., 1984, v. 17(2), p. 74-76.
35. Burdette W.J. Bioassay of human tissue for ecdysone. - Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 1962, v. 110, p. 730-731.
36. Burdette W.J. The concept of hormonal heterophylly. - In: Invertebrate endocrynology and hormonal heterophylly. Ed. by Burdette W.J. Berlin etc., Springer, 1974(a), p. 331-337.
37. Burdette W.J. Invertebrate hormones and tumors. - In: Ibidus, 1974(b), p. 351367.
38. Burdette W.J., Coda R.L. Effect of ecdysone on inverparation of 14C-leucine into hepatic protein in vitro. - Proc.Soc.Exptl.Biol.Med., 1963, v. 112, p. 216-217.
39. Catalan R.E., Aragones M.D., Martinez A.M. Effect of ecdysterone on the cyclic AMP and cyclic GMP in mouse plasma. - Biochim.Biophys.Res.Commun., 1979(a), v. 87, p. 1018-1023.
62
40. Catalan R.E., Aragones M.D., Martinez A.M. Effect of ecdysterone on the cyclic AMP-protein kinase system in mouse liver. - Biochim.Biophys.Res.Commun., 1979(b), v. 89, p. 44-49.
41. Catalan R.E., Martinez A.M., Aragones M.D., Miguel B.G., Robles A., GodoyJ.E. Effect of ecdysterone treatment on the cyclic AMP-protein kinase system in adipose tissue. - J.Steroid Biochem., 1982(a), v. 16, p. 573-576.
42. Catalan R.E., Martinez A.M., Aragones M.D. In vitro effect of ecdysterone on protein kinase activity. - Comp.Biochem.Physiol., 1982(b), v. 71B, p. 301-303.
43. Gizmarik J., Trupl J. Propolis-Wirkung auf Hautpilze. - Pharmazie, 1976, Bd. 31, No 1, s. 55.
44. Cohen J.A., Oosterbaan R.A., Berends F. Organophosphorus compounds. - In: Methods in enzymology. N.Y. and London, Academic Press, 1967, v. 11, p. 686-702.
45. Davis B.J. Disc electrophoresis II. Method and application to himan serum proteins. - Ann.N.Y.Acad.Sci., 1964, v. 121, p. 404-427.
46. Dixit P.K., Patel N.G. Insulin-like activity in larval foods of the honeybee. - Nature, 1964, v. 202, p. 189-190.
47. Dudziak B., Jozwik Z., Paszewski A. Experiments on the activity of several extracts from the larvae of Galleria mellonella L. On Mycobacterium tuberculosis 607. - Ann.Univ.M.CurieSklodowska, 1962, v. 17, No 14C, p. 454-461.
48. Eguchi M., Iwamoto A. Alkaline proteases in the midgut tissue and digestive fluid of the silkworm, Bombyx mori. - Insect Biochem., 1976, v. 6, p. 491-496.
49. Eguchi M., Iwamoto A. Comparison of three alkaline proteases from digestive fluid of the silkworm, Bombyx mori. - Comp.Biochem.Physiol., 1982, v. 71B, p. 663668.
63
50. Ellnain-WojtaszekM., Hladon B., Bulka W., Skrzypczak L., SzafarekP., Chodera A., Kowalewski Z. Isolation and study of cytostatic activity of components of propolis DEEP ether fraction. - HerbaPol., 1982, v. 28 (1-2), p. 51-59. Chem.abs. 98: 122857d.
51. Esanu V., Prahoveanu E., Grisan I., Cioca A. The effect of aqueous propolis extract, of rutin and of rutin-quercetin mixture on experimental influenza virus infection in mice. - Rev.Roum.Med. Virol., 1981, v. 32(3), p. 213-215, Chem.abs. 96: 135370y.
52. Farag R.S., Ahmed A.I., Rashad S.E., Ewies M.A. Unsaponifiable matter of six pollens collected by honeybees in Egypt. - J.Aptic.Res., 1980, v. 19 (4), p. 248-254. Chem.abs.: 94: 188637f.
53. Gilbert L.I., Schneiderman H.A. Occurence of substances with juvenile hormone activity in adrenal cortex of vertebrates. - Science, 1958, v. 128, p. 844.
54. Gold A.M. Sulfonylation with sulfonyl halides. - In: Methods in enzymology. N.Y. and London, Academic Press, 1967, v. 11, p. 706-711.
55. Hikino H., Takemoto T. Arthopoid molting hormones from plants Achyranthes and Cyathula. - Naturwissenschaften, 1972, v. 59, p. 91-98.
56. Hink W.F., Briggs J.B. Bactericidal factors in haemolymph from normal and immune wax moth larvae, Galleria mellonella. - J.Insect.Physiol, 1968, v. 14, p. 10251034.
57. Hoffmann D., Hultmark D., Boman H.G. Insect immunity: Galleria mellonella and ither Lppidoptera have cecropia-P9-like factors active against gram negative bacteria. - Insect. Biochem., 1981, v. 11, p. 537-548.
58. Horn D.H.S., Bergamasco D. Chemistry of ecdysteroids. - In: Comprehensive insect physiology, biochemistry and pharmacology. Ed. by Kerkut G.A., Gilbert L.I. Oxford etc., Pergamon Press, 1985, v. 7, p. 185-248.
64
59. Hsiao T.H., Hsiao C. Ecdysteroids in the ovary and the egg of the great wax moth. - J.Insect Physiol., 1979, v. 25, p. 45-52.
60. Ionescu M., Garagiani S. Free amino acids contained in the bee-gathered pollen around the Baneasa-Lehliu area. - Apic.Rom., 1977, v. 52 (10), p. 16-17.
61. Ivanov Ts. Glucose oxidase, catalase and proteolytic enzyme activity and enzyme inactivation in heated and preserved honey. - Zhivotnovud.Nauki, 1981, v. 18 (6), p. 119125. Chem.abs. 96: 179755g.
62. Ishaaya I., Moore I., Joseph D. Protease and amylase activity in larvae of the Egyptian cotton worm Spodoptera littoralis. - J.Insect.Physiol., 1971, v. 17, p. 945-953.
63. Jungreis A.M., McCaled D.C., Kumaran A.K. Hemolymph y-aminobutyric acid titres in the greater wax moth, Galleria mellonella: changes during normal or supernumerary larval development and following injury/ - Comp.Biochem.Physiol., 1980, v. 67C, p. 167-172.
64. Kaczmarek F., Debowski W.J. a- and (3-amylase in propolis. - Acta Pol.Pharm., 1983, v. 40(1), p. 121. Chem.abs. 99: 119344z.
65. Kerkut G.A., Gilbert L.I., editors. Compehensive insect physiology, biochemistry and pharmacology. Oxford etc., Pergamon Press, v. 1-13, 1985.
66. Kramer K.J., Tager H.S., Childs C.N., Speirs R.D. Insulin-like hypoglycemic and immunological activities in honeybee royal jelly. - J.Insect Physiol., 1977, v. 23, p. 293295.
67. Kramer K.J., Childs C.N., Spiers R.D., Jacobs R.M. Purification of insulin-like peptides from insect hemolymph and royal jelly. - Insect Biochem., 1982, v. 12, p. 9198.
68. Kvanta E. Sterols in pollen. - Acta Chem.Scand., 1968, v. 22, p. 2161-2165.
65
69. Kucera M., Sehnal F., Mala J. Effect of developmental derangements on the proteolytic and protease-inhibitory activities in Galleria mellonella (Insecta). - Comp.Biochem.Physiol., 1984, v. 79B, p. 255-261.
70. Kuzniecow A., Wojciehowski E. Wplyw wyciagow z larw Galleria mellonella na wzrost pratkow gruzlicy. - Med.Dosw.Microbiol., 1950, v. 2, No 2, p. 246-249.
71. Laychock S.G. The biochemistry of cell activation as related to the putative actions of flavonoids. - In: Plant flavonoids in biology and medicine: biochemical, pharmacological and structure-activity relationships. Alan R. Liss, Inc., 1986, p. 215-229.
72. Lecomte J., Bourdon V., Damas J., Leclercq M. Presence of noradrenaline, free and conjugated, in bees honey. - Arch.Int.Physiol.Biochim., 1976, v. 84 (4), p. 877-878. Chem.abs. 86: 86417b.
73. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. - J.Biol.Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.
74. LupienP.J., Hinse C., Chaudhary K.D. Ecdysone as a hypocholesterolemic agent. - Arch.Int.Physiol.Biochim., 1969, v. 77 (2), p. 206-212.
75. Malaiu A., Polos E., Cucu N. Data on the effect of temperature on activity of some honey enzymes. - Apic.Rom., 1979, v. 54 (10), p. 4-7. Chem.abs. 92: 213637z.
76. Mankiewicz E. The lipidolytic enzymes of larvae of Galleria mellonella. - Ca- nad.J.Res., 1949, v. 27, No 3, p. 195-201.
77. Mankiewicz E. The action of lipidolytic enzymws of larvae of Galleria mellonella on virulent Mycobacterium tuberculosis. - Canad.J.Med.Sci., 1952, v. 30, No 1, p. 106112.
78. Masuoka M., Prita S., Shino A., Matsuzawa T., Nakayama R. Pharmacological studies of insect metamorphosing hormone: Ponasterone A, ecdysterone, and inokoster- one in the rat. - Jap.J.Pharmacol., 1970, v. 20, p. 142-156.
66
79. Matsuda H., Kawaba Т., Yamamoto Y. Pharmacological studies of insect meta- morp-hosing steroids from Achyranthis radix. - Folia Pharmacol. Japon., 1970, v. 66, p. 551-563.
80. Matsuda H., Kawaba Т., Yamamoto Y, Ogawa S. Effect of ecdysterone on experimental atherosklerosis in rabbit. - Folia Pharmacol. Japon., 1974, v. 70, p. 325-339.
81. Meresta L., Meresta T. Effect of pH on bactericidal activity of propolis. - Bull.Vet.Inst.Pulawy, 1980, v. 24 (1-4), p. 21-25.
82. Metalnikov S.I. Contribution a Fimmunite de mite des ruches d'abeilles (Galleria mellonella) vis-a-vis de Г infection tuberculeuse. - Архив биологических наук, издаваемый императорским институтом экспериментальной медицины в С.Петербурге, 1906, т. 12, № 1, с. 300-317.
83. Metalnikov S. I/immunite naturelle et acquise chez la chenille de Galleria mellonella. - Annales de llnstitut Pasteur, 1920, v. 34, p. 888-909.
84. Metzner J., Bekemeier H., Paintz M., Schneidewind E. Antimicrobial activity of propolis and propolis constituents. - Pharmazie, 1979, Bd. 34 (2), s. 97-102. Chem.abs. 91: 84014x.
85. Miller J.A. Call of the tumor: Chemical trigger for blood vessel growth. - Sci.News, 1985, v. 128, No 14, p. 213.
86. Miller J. W., Kramer K.J., Law J.H. Isolation and partial characterization of the larval midgut trypsin from the tobacco hornworm, Manduca sexta johannson (Lepidop- tera: Sphingidae). - Comp.Biochem.Physiol., 1974, v. 48B, p. 117-129.
87. Nakanishi K, Koreeda M., Dasaki S., Chang M., Hsu H.Y. Insect hormones. I. The structure of ponasterone A, an insect molting hormone from the leaves of Podocar- pus nakaii Hay. - J.Chem.Soc., Chem.Commun., 1966, p. 915-917.
67
88. Ogawa S., Nishimoto N., Matsuda H. Pharmacology of ecdysones in vertebrates. - In: Insect endocrynology and hormonal heterophylly. Ed. By Burdette W.J. Berlin etc., Springer, 1974, p. 341-344.
89. Olivier H.R. Antibiotic action of an extract of Galleria mellonella. - Nature, 1947, v. 159, No 4046, p. 685.
90. Olivieri M., Ginocchi G. Antimicrobial effect of propolis. - Cron.Farm., 1981, v. 24 (2), p. 94-96. Chem.abs. : 144577c.
91. Paintz M., Metzner J. Local anesthetic effect of propolis and some of its constituents. - Pharmazie, 1979, v. 34 (12), p. 839-841. Chem.abs. 92: 174470t.
92. Paszewski A. Influence of an enzyme extract from the larvae of Galleria mellonella together with penicillin or sulphatiazole on the growth of Mycobacterium tuberculosis 607. - Ann.Univ.M. Curie-Sklodowska, 1959, v. 14, No 20C, p. 435-438.
93. Plantevin G., DeReggi M., Nardon C. Changes in ecdysteroid and juvenile hormone titres in the hemolymph of Galleria mellonella larvae and pupae. - Gen.Comp.Endocrynol., 1984, v. 56, p. 218-230.
94. Powning R.F. and Davidson W.J. Studies on insect bacteriolytic enzymes-1. Ly- sozyme in haemolymph of Galleria mellonella and Bombyx mori. - Comp.Biochem.Physiol., 1973, v. 45B, p.669-681.
95. Pritchett D. W., Young S.Y., Geren C.R. Proteolytic activity in the digestive fluid of larvae of Trichoplusia ni. - Insect Biochem., 1981, v. 11, p. 523-526.
96. Reisfeld R.A., Lewis U.J., Williams D.E. Disc electrophoresis of basic proteins and peptides on polyacrylamide gels.-Nature, 1962, v. 195, p. 281-283.
97. Riddiford L.M. Hormone action at the cellular laval. - In: Comprehensive insect physiology, biochemistry and pharmacology. Ed. By Kerkut G.A., Gibbert L.I., Per- gamon Press, Oxford etc., 1985, v. 8, p. 37-84.
68
98. Riordan J.F., Vallee B.L. Reactions with N-ethylmaleimide and p- mercuribenzoate. - In: Methods in enzymology. N.Y. and London, Academic Press, 1967, v. 11, p. 541-548.
99. Ross R., Glomset J., Kariya B., Marker L. A platelet-dependent serum factor that stimulates the proliferation of arterial smooth muscle cells in vitro. - PNAS USA, 1974, v. 71, p. 1207-1210.
100. Ross R., Vogel A. The platelet-derived growth factor. - Cell, 1978, v. 14, p. 203210.
101. Saden-Krehula M., Tajic M., Kolbah D. Testosterone, episterone and andro- stenedione in the pollen of Scots pine (P.Silvestris L.). - Experientia, 1971, v. 27, p. 108109.
102. Saden-Krehula M., Tajic M., Kolbah D. Investigation of some steroid hormones and their conjugates in pollen of Pinus nigra Ar.Separating steroids by thin-layer chromatography. - Biol.Zbl., 1976, v. 95, p. 223-226.
103. Sasaki T., Suzuki Y. Alkaline proteases in digestive juice of the silkworm, Bom- byz mori. - Biochim.Biophys.Acta, 1982, v. 703, p.1-12.
104. Schneidewind E.M., Kala H., Linzer B., Metzner J. Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe von Propolis. - Pharmazie, 1975, Bd. 30 (12), s. 803.
105. Sehnal F., Maroy P., Mala J. Regulation and significance of ecdysteroid titres fluctuation in lepidopterous larvae and puper. - J.Insect Physiol., 1981, v. 27, p. 535-544.
106. Slama K Physiological effects of ecdysoids. - In: Insect hormones and bioana- loques. Slama K., Romanuc M., Sorm F. Wien, Springer, 1974, p. 339-387.
107. Standifer L.N., McCanghey W.F., Dixon S.E., Gilliam M., Loper G.M. Biochemistry and microbiology of pollen collected by honey bees (Apis mellifera L.) from almond, Prunus dulcis. II. Protein, amino acids and enzymes. - Apidologie, 1980, v. 11 (2), p. 163-171. Chem.abs. 93: 237473q.
69
108. Stephens J.M. and Marshall J.H. Some properties of an immune factor isolated from the blood of actively immunized wax moth larvae. - Canad. J.Microbiol., 1962, v. 8, p. 719-725.
i
109. Takenaka Т., Echigo T. Properties and transglucosidation action of a- glucosidase of honey. Part 2. - Tamagawa Daigaki Nogakubu Kenkyu Hokoku, 1978, No 18, p. 22-31. Chem.abs. 91: 86208n.
110. Uchiyama M. and Otaka T. Phytoecdysones and protein metabolism in mammalia. - In: Invertebrate endocrynology and hormonal heterophylly. Ed. By Burdette W.J., Springer. Berlin etc., 1974, p. 375-400.
111. Valente D., Marques L.A.C., Mendes E.G. The acetylcholine content of honeys from different bees as determined in four-point-assays. - Comp.BiochemPhysiol., 1981, v.69C, p. 161-164.
112. Ward C.W. Properties and specificity of the major metal-chelator-sensitive proteinase in the keratinolytic larvae of the webbing clothes moth. - BiochemBiophys.Acta, 1975(a), v. 384, p. 215-227.
113. White J. W. Jr., Composition of honey. - In: Honey: a comprehensive survey. Ed. By Crane E. Crane, Russak and Company Inc., N.Y., 1975, p. 157-206.
114. Wigglesworth V.B. The principles of insect physiology. London, Methuen and Co Ltd., 1967,741р.
115. Williams C.M., MoorheadL.V., Pulis J.F. Juvenile hormone in thymus, human placenta and other mammalian organs. - Nature, 1959, v. 183, p., 405.
116. Мухин С.А. О некоторых вопросах гомеопатического лечения болезней сердца (О новом подходе в лечении инфаркта миокарда). Московское научно- медицинское общество врачей-гомеопатов. М., 1961. 42 с.
70
ПРИЛОЖЕНИЕ
Список сокращений встрещающихся в тексте.
ХСН - хроническая сердечная недостаточность
ЧСС - частота сердечных сокращений
ИАПФ- ингибиторы ангиотензин превращающих ферментов
СГ - сердечные гликозиды
ПГ - простагландины
МХ - митохондрии
АХ - ацетилхолин
РМБР - фенилметилсульфонил фторид (ингибитор сериновых ферментов
ДБР - диизопропил фторфосфат (ингибитор сериновых ферментов)
РСМВ - пара-хлормеркурийбензоат (ингибитор тиоловых ферментов)
КЕМ - этилмалеимид (ингибитор тиоловых ферментов) ЭДТА - этилен-диамин-тетра-уксусная кислота (ингибитор
металлсодержащих ферментов) ЭКГ - электрокардиограмма РВГ - реовазограмма ЭМГ - электромиограмма АД - артериальное давление
отрицательный десятичный логарифм
71
к стр.51
В эксперименте на автоматизированном компьютерном комплексе экспресс-диагностики приняли участие добровольцы из числа студентов и сотрудники лаборатории функциональной диагностики всего 20 человек. На каждого обследуемого заполнялась разработанная нами индивидуальная карта, в которую вносились антропологические данные, степень физической подготовки, субъективная разбивка времени суток для сна, отдыха, занятий (лекции) и спорт. Перед приемом БАД все добровольцы-испытуемые проходили полипараметрическое обследование на автоматизированном комплексе экспресс-.диагностики, чтобы оценить исходный уровень функционального состояния. Ниже приводятся индивидуальные карты и протоколы экспериментов при однократном применении БАД в виде экстракта из личинок (в . т .) , курсовом (длившемся 15дней) и после действия БАД через 15 дней студентки Донской Л.Ф.
Индивидуальная карта пациента
Фамилия, Имя,Отчество____________________________________
Дата и год рождения_______________ возраст________________
Пол_______ рост__________ вес____________
Вид деятельности____________________________________________
Субъективная оценка времени затрачиваемое на сон__ отдых______
Занятия спортом__________________
Работу, учебу______________________
Другие виды деятельности____________________________________
Субъективная оценка уровня собственного здоровья_______
БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаю искреннюю признательность и благодарность лаборатории системного анализа физиологических функций руководитель д.м.н., профессор Дмитриева Н.В. и научным сотрудникам Донской Л.Ф. и Агафоновой В.В. за участие и помощь в оформлении диссертационной работы.
Выражаю благодарность оппонентам д.м.н. профессору Полиевскому С.А. и д.х.н.,профессору Голубеву В.Н. за оппонирование и благосклонность к моей работе.
Выражаю искреннюю благодарность совету по защите диссертаций НИИФК и лично д.м.н. профессору Калинкину Л.А. ученому секретарю к.б.н. Челнокову В.А., техническому секретариату за неоценимую помощь в подготовке и оформлении сопроводительных документов.
Благодарю родных и близких за моральную и материальную поддержку, понимание и долготерпение.
[1]Работа проводилась совместно с д.б.н. Архиповым.